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《第二军医大学》 2017年
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低能量1064nmQ开关Nd:YAG激光对角质形成细胞和成纤维细胞的生物学作用与机制研究

秦晓峰  
【摘要】:随着社会的不断进步和人民生活水平的不断提高,皮肤老化的问题越来越受到人们的关注。皮肤老化的诸多表现,如皮肤松弛、变薄、皱纹增多、色素增加、毛孔粗大、毛细血管扩张等不仅有碍美观,甚者加重患者心理负担、降低自信心,继而可能会进一步影响正常社交及工作。激光治疗皮肤老化充分显示其有效性及优点,关注程度与日俱增,成为各方研究的焦点。研究表明,皮肤抗氧化能力增强、基质金属蛋白酶活性下降以及胶原蛋白合成增加是激光治疗皮肤老化的关键环节,但其具体机制尚不明确。最新研究显示,S100A8蛋白下调抑制RAGE受体激活、进而抑制MAPK、NF-κB信号通路及下游转录因子AP-1,这可能是联系上述关键环节的重要途径。虽然激光治疗皮肤老化的临床有效性已逐步为各方认同,但其具体的分子生物学机制尚未得到完全阐明。故而,治疗使用中存在一定程度的经验依赖性及不易量化性,因此,探讨其相关分子机制将为更合理应用激光治疗皮肤老化提供理论依据。本研究选择1064nm Q开关Nd:YAG激光为光源,以Ha Ca T细胞、小鼠成纤维细胞为实验对象,采用细胞培养、细胞转染、RNA干扰技术、Real-time PCR、Western blot等方法研究1064nm Q开关Nd:YAG激光治疗皮肤老化中S100A8蛋白、RAGE受体及其介导的MAPK、NF-κB信号通路所发挥的作用,阐明激光作用的信号机制及作用靶点,以便为激光更好地用于皮肤老化治疗提供坚实理论依据。第一部分1064nm Q开关Nd:YAG激光照射对Ha Ca T细胞、小鼠成纤维细胞增殖和抗氧化能力的影响[目的]探讨1064nm Q开关Nd:YAG激光对Ha Ca T细胞和小鼠成纤维细胞增殖和抗氧化能力的影响。[方法]利用CCK8试剂盒检测激光照射组和对照组细胞增殖能力的变化,流式细胞仪检测激光照射组和对照组细胞ROS水平的变化,超氧化物歧化酶测定试剂盒测定激光照射组和对照组细胞SOD活力的变化。[结果]Ha Ca T细胞、小鼠成纤维细胞经1064nm Q开关Nd:YAG激光照射后细胞形态、增殖能力、ROS水平均无明显改变,但是SOD活力明显上升,且激光能量越高,SOD水平越高。[结论]1064nmQ开关Nd:YAG激光照射不会对细胞和小鼠成纤维细胞造成损伤,激光治疗皮肤老化是安全的。同时,1064nm Q开关Nd:YAG激光照射不仅不会促进氧化应激反应,而且能够增强细胞的抗氧化能力,提示激光治疗皮肤老化可能与其促进细胞抗氧化物的表达有关。第二部分1064nm Q开关Nd:YAG激光照射对小鼠成纤维细胞胶原蛋白合成和降解的影响[目的]探讨1064nmQ开关Nd:YAG激光照射对小鼠成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白合成和降解的影响。[方法]应用Real-time PCR技术从转录水平检测激光照射组和对照组细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、MMP-1、MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2在m RNA水平表达的差异。[结果]1064nmQ开关Nd:YAG激光照射24小时后小鼠成纤维细胞Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白m RNA表达显著增高,MMP-1、MMP-2 m RNA表达显著降低,MMP-9的表达无明显变化,TIMP-1、TIMP-2 m RNA表达显著增高。[结论]1064nm Q开关Nd:YAG激光照射能够促进小鼠成纤维细胞合成Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白,可能与抑制MMP-1、MMP-2的表达、促进TIMP-1、TIMP-2的表达有关。第三部分1064nm Q开关Nd:YAG激光照射对Ha CaT细胞、小鼠成纤维细胞炎症反应的影响[目的]探讨1064nm Q开关Nd:YAG激光照射对Ha Ca T细胞、小鼠成纤维细胞炎症反应的影响。[方法]应用Real-time PCR技术检测激光照射组和对照组细胞RAGE、S100A8、TGF-β、TNF-α、IL-6等炎症相关因子m RNA表达的差异,Western Blot检测激光照射组和对照组细胞RAGE、S100A8等炎症相关因子蛋白质表达的差异。[结果]1064nmQ开关Nd:YAG激光照射后细胞S100A8、RAGE、TGF-β、TNF-α在m RNA水平表达均显著增加,1064nm Q开关Nd:YAG激光照射后Ha Ca T细胞、小鼠成纤维细胞S100A8、RAGE蛋白表达显著增加。[结论]1064nmQ开关Nd:YAG激光照射能够上调细胞和小鼠成纤维细胞S100A8、RAGE的表达,进而引起炎症反应,促进相关炎症因子的表达,激活参与胶原合成和降解的信号通路。第四部分1064nm Q开关Nd:YAG激光照射对Ha Ca T细胞、小鼠成纤维细胞表达MAPK和NF-kB信号通路的影响[目的]探讨1064nmQ开关Nd:YAG激光照射对HaCa T细胞、小鼠成纤维细胞表达MAPK和NF-kB信号通路的影响。[方法]应用RNA干扰、Real-time PCR技术检测S100A8、siS100A8对HaCa T细胞表达TGF-β、TNF-α、IL-6、IL-8等炎症因子的影响,S100A8、si S100A8对小鼠成纤维细胞合成Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白的影响,Western Blot技术检测1064nm Q开关Nd:YAG激光照射对Ha Ca T细胞、小鼠成纤维细胞表达MAPK信号通路中ERK1/2、JNK、p38和NF-κB信号通路中p65蛋白的影响。[结果]Ha Ca T细胞用si S100A8处理48小时后,炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β表达均显著下降,Ha Ca T细胞用S100A8处理24小时后,炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β表达均显著增加;小鼠成纤维细胞用si S100A8处理后,Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白m RNA表达显著降低,小鼠成纤维细胞用S100A8处理24小时后,Ⅲ型胶原蛋白在m RNA水平表达显著增加;Ha Ca T细胞经1064nm Q开关Nd:YAG激光照射1小时、3小时后,p-p65、p-p38、p-JNK蛋白表达显著增高,而小鼠成纤维细胞经1064nm Q开关Nd:YAG激光照射1小时、3小时后,p-p38蛋白表达显著增高。[结论]1064nm Q开关Nd:YAG激光照射激活了Ha Ca T细胞中p-p65、p-p38、p-JNK这些信号因子的活性以及小鼠成纤维细胞中p-p38的活性,而这些信号因子都是由S100A8启动的,它们共同参与了1064nm Q开关Nd:YAG激光诱导的皮肤胶原蛋白合成的调节。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R62

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