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《第二军医大学》 2017年
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富血小板血浆促进皮肤软组织扩张新生的研究

王金明  
【摘要】:背景皮肤软组织扩张术目前在整形外科临床广泛应用,但也存在治疗周期较长,并发症相对较多和皮肤有效扩张量不足的缺点。如何能在尽可能短的扩张时间内获得面积大并且质地良好的额外皮肤,成为皮肤软组织扩张基础和临床研究的方向。目前仍没有安全、可靠、操作简便的方法来改善皮肤软组织扩张的效率。富血小板血浆(PRP)是自体血经过离心分离得到的血小板的浓聚物。血小板α-颗粒激活后释放多种生长因子,如血小板衍生生长因子(PDGF),成纤维细胞生长因子(FGF)和血管内皮生长因子(VEGF)等20余种生长因子。实验和临床研究已经证明PRP在组织修复和再生中发挥重要的生物学作用。然而,没有文献报道PRP是否对皮肤组织扩张有促进作用。本课题通过体内外实验来研究PRP对皮肤软组织扩张的作用。目的(1)构建一个可靠、科学的皮肤软组织扩张动物模型,为后期的实验奠定基础。(2)研究PRP对兔耳皮肤扩张的作用。(3)研究PRP对人永生化角质形成细胞(HaCaT)体外培养增殖的作用。(4)研究PRP对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养增殖的作用。方法(1)在兔左右两耳背侧皮下分别埋置10ml圆形皮肤软组织扩张器,手术切口愈合后,通过一“Y”形三通管同时给扩张器注入生理盐水,每两天注水一次,注水时注意避免因张力过大导致皮肤坏死。注水完成后取出扩张器,测量注水的总体积,统计比较两侧注水量。(2)将兔左右两耳随机分为PRP组和对照组,采用Landesberg二次离心法获取PRP,用牛凝血酶激活形成PRP凝胶;PRP组在手术中拟扩张区域皮下均匀注射1.0m L的自体PRP,用相同体积的生理盐水注射对照组皮下;将10ml圆形皮肤软组织扩张器埋置兔耳皮下,切口愈合后定期给扩张器注入生理盐水。注水完成后,统计比较实验组和对照组的注水量;行HE染色观察组织结构;Masson染色观察组织胶原;CD31、α-SMA检测组织血管增生情况;PCR检测组织中VEGF的表达。(3)采用Landesberg二次离心法获取PRP并激活,对照组为常规培养基培养HaCaT细胞,实验组为在常规培养基添加10%PRP。用MTT检测PRP对HaCaT细胞的活性增殖作用,酶联免疫吸附实验测定培养液中EGF的浓度,流式细胞仪检测PRP对HaCaT细胞的细胞周期变化的影响。(4)采用Landesberg二次离心法获取PRP并激活,对照组为常规培养基培养HUVEC细胞,实验组为在常规培养基添加10%PRP。用MTT检测PRP对HUVEC细胞的活性增殖作用,酶联免疫吸附实验测定培养液中VEGF的浓度,流式细胞仪检测PRP对HUVEC细胞的细胞周期变化的影响。结果(1)兔左侧耳部扩张器注水平均量为21.3±1.6ml,右侧耳部扩张器注水平均量为20.9±1.1ml,未见统计学差异。(2)全血中血小板的平均数为(30.35±1.85)×10~4/μl。平均PRP血小板计数为(165.55±11.94)×10~4/μl,与全血相比,在PRP中发现血小板计数增加约5.5倍;扩张器注水完成后PRP组的平均注水体积为35.8±1.6ml,对照组为24.2±1.6ml,差异具有统计学意义;HE染色显示PRP组的表皮厚度大于对照组,在PRP组的表皮基底层观察到更多的增殖细胞,PRP组表皮平均厚度为89.96±10.07μm,对照组为52.02±4.36μm;Masson染色显示PRP组中有更多的胶原纤维束;抗CD31、α-SMA免疫组织化学染色显示在PRP组中皮肤有更多的毛细血管;qPCR检测扩张皮肤中VEGF的表达,PRP组中VEGF的表达显着高于对照组,约2.33±0.67倍。(3)MTT结果显示10%PRP对HaCaT细胞增殖明显有促进作用;酶联免疫吸附实验测定PRP组培养液中EGF的浓度要高于对照组,差别具有统计学意义;流式细胞检测处于S期和G2/M期的细胞所占比例较对照组高,处于G0/G1期的细胞所占比例较对照组低,即PRP能够促进HaCaT的细胞周期从G0/G1期进入S期,促进细胞增殖。(4)MTT结果显示10%PRP对HUVEC细胞增殖明显有促进作用;酶联免疫吸附实验测定PRP组培养液中VEGF的浓度要高于对照组,差别具有统计学意义;流式细胞检测处于S期和G2/M期的细胞所占比例较对照组高,处于G0/G1期的细胞所占比例较对照组低,即PRP能够促进HUVEC的细胞周期从G0/G1期进入S期。结论(1)此兔耳的扩张模型采用自身对照,能较好消除实验的混杂因素,结果客观、可靠。(2)在上述兔耳模型基础上研究PRP对皮肤软组织扩张的作用,实验表明:PRP能促进皮肤表皮细胞增殖,毛细血管增生,提高皮肤软组织的扩张效率。(3)体外研究表明:PRP能促进HaCaT细胞增殖,机制可能与PRP中的EGF有关。(4)体外研究表明:PRP能促进HUVEC细胞增殖,机制可能与PRP中的VEGF有关。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R622

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