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《第二军医大学》 2017年
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微管蛋白翻译后修饰在DRG轴突生长和马尾神经损伤后修复中的作用及机制研究

傅智轶  
【摘要】:背景背根神经节(Dorsal root ganglion neuron,DRG)神经元为假单极神经元,其发出的轴突外周支构成了脊神经感觉部分,损伤后可以有效的再生,例如腰椎间盘突出症患者经手术减压后下肢疼痛、麻木症状缓解明显;其发出的轴突中枢支经后根进入脊髓,其中由腰骶部(腰3以下)DRG发出的中枢支轴突构成了马尾神经的感觉部分,损伤后再生困难,例如由中央型腰椎间盘突出压迫引起的马尾神经综合征(cauda equina syndrome,CES)患者的会阴区感觉麻木等症状恢复困难。DRG轴突中枢支和外周支损伤后再生能力差别显著的内在原因目前尚不完全清楚。微管(Microtubules,MTs)作为神经元重要的细胞骨架,是轴突生长的重要参与者。有研究提示,乙酰化、去乙酰化等微管蛋白的翻译后修饰(post-translational modification,PTM)可能对轴突生长起重要调节作用,但具体机制不清。我们前期工作发现,改变微管聚合状态可以调控DRG神经元轴突生长,也有研究提示,乙酰化、酪氨酸化等微管蛋白的翻译后修饰可能对轴突生长起重要调节作用,但具体机制不清。本研究拟在获得微管修饰酶在神经系统中表达谱的基础上,建立大鼠马尾神经损伤、相应节段脊神经损伤等实验模型,利用药理学阻断剂,以共聚焦实时成像等方法观察背根神经节(Dorsal root ganglion neuron,DRG)神经元的轴突生长和再生,以大鼠行为学检测进行功能学评价,通过探索微管蛋白翻译后乙酰化/去乙酰化修饰在大鼠背根神经节中枢支和外周支损伤后的表达差异及作用影响,明确在马尾神经损伤修复中起关键调节作用的微管蛋白翻译后修饰酶,并阐明其内在机制,为临床治疗提供新的靶点和思路。研究目的建立并改进大鼠马尾神经压迫损伤和相应节段脊神经结扎模型,力求对椎管狭窄压迫马尾神经和丝线结扎损伤脊神经进行最真实的模拟。建立实验模型后,分离相应DRG组织,通过免疫组化和免疫印迹的方法验证靶标微管PTM酶在两种损伤模型中的差异表达,筛选鉴定在马尾神经损伤修复中起到关键作用的微管蛋白翻译后修饰(post-translational modification,PTM)酶。体内实验分析靶标PTM酶对DRG神经元轴突再生和神经功能恢复的作用。研究方法1、动物模型建立1)脊神经结扎模型建立方法:采用10%水合氯醛(3mL/kg)行腹腔内注射麻醉。大鼠麻醉后,剪除腰骶部皮毛,以双侧髂嵴连线(平L_(5/6)间隙水平)作为标志,沿L_(4-6)棘突做纵行切口,切开皮下筋膜,分离骶棘肌,咬除L_(5-6)节段椎板,暴露硬膜囊及一侧L_5、L_6DRG。沿DRG外侧出椎间孔的脊神经处予以1号丝线结扎。2)马尾神经压迫模型建立方法:采用10%水合氯醛(3mL/kg)行腹腔内注射麻醉。大鼠麻醉后,剪除腰骶部皮毛,以双侧髂嵴连线(平L_(5/6)间隙水平)作为标志,沿L_(3-6)棘突做纵行切口,切开皮下筋膜,分离骶棘肌,咬除L_4节段椎板,暴露硬膜囊。将长10 mm、厚1.0 mm、宽1.0 mm的硅胶条向下置入大鼠L_(4-6)椎管内,手术过程注意不损伤硬膜囊。3)假手术组模型建立方法:麻醉、定位方法同上,仅切开皮肤、皮下筋膜,分离骶棘肌。2、在马尾神经损伤修复中起到关键作用的微管蛋白PTM酶的筛选鉴定将50只SD大鼠随机分为脊神经结扎24h组、脊神经结扎48h组、马尾神经压迫24h组、马尾神经压迫48h组、假手术对照组,每组10只。在损伤24、48小时后(假手术组术后24h),分离提取每组大鼠相应节段(一侧L5、6)DRG组织,通过实时荧光定量PCR检测、免疫印迹和免疫荧光的方法进一步验证靶标微管PTM酶在两种损伤模型中的差异表达。3、体内实验分析靶标PTM酶对DRG神经元轴突再生和神经功能恢复的作用根据第2阶段实验结果,脊神经结扎组在损伤24、48小时后去乙酰化酶(HDAC6)表达量均极显著低于马尾神经压迫组。将30只SD大鼠随机分为假手术组、马尾神经压迫对照组、马尾神经压迫实验组,每组10只。实验组在造模后以10mg/kg的HDAC6抑制剂(Tubastatin A,4%DMSO+30%PEG300+66%纯水溶解,浓度5mg/ml,Selleck公司,美国)连续腹腔注射1周,对照组在造模后注射相应溶剂,剂量、时间、方法相同。假手术组无药物干预。予造模后1d、3d、5d、7d行甩尾实验检测大鼠尾部痛温觉和运动功能。予造模后7天分离提取每组大鼠相应节段(双侧L5、6)DRG组织及马尾神经组织,通过免疫印迹和免疫荧光的方法检测DRG神经元内HDAC6含量,同时行TUNEL染色检测DRG神经元凋亡情况,行苏木精-伊红染色检测马尾神经损伤情况。结果1、成功建立并改进大鼠马尾神经压迫损伤和相应节段脊神经结扎模型:HE染色发现假手术组DRG神经元细胞及神经纤维结构紧密有序,未见节内神经纤维轴突肿胀、髓鞘肿胀、脱髓鞘等改变。脊神经结扎组和马尾神经压迫组DRG神经元细胞松散,个别出现凋亡小体,部分神经纤维髓鞘肿胀、脱髓鞘。TUNEL染色显示假手术组DRG组织中可见个别阳性细胞;脊神经结扎组和马尾神经压迫组DRG中可见大量阳性细胞。Caspase 3染色显示假手术组DRG组织中,未见阳性的胞浆棕黄色染色细胞。脊神经结扎组和马尾神经压迫组DRG组织中可见大量阳性的胞浆棕黄色染色细胞。Bax染色显示假手术组DRG组织中,可见少量阳性的胞浆棕黄色染色细胞。脊神经结扎组和马尾神经压迫组DRG组织中可见大量阳性的胞浆棕黄色染色细胞。2、实时荧光定量PCR、蛋白免疫印迹和免疫荧光检测均显示脊神经结扎组在损伤24、48小时后DRG中微管蛋白乙酰化酶(NAT1,MEC-17)表达量均高于马尾神经压迫组,且呈现逐渐增高的趋势;去乙酰化酶(Sirt2,HDAC6)表达量均低于马尾神经压迫组,且呈现逐渐降低的趋势。其中的大部分差异有统计学意义。另外,手术干预四组的乙酰化酶表达量均高于假手术对照组,去乙酰化酶表达量均低于假手术对照组。实时荧光定量PCR检测:脊神经结扎24h组DRG中MEC-17表达量显著高于马尾神经压迫24h组(P0.01);脊神经结扎48h组DRG中MEC-17表达量显著高于马尾神经压迫48h组(P0.05);脊神经结扎48h组DRG中Sirt2表达量显著低于马尾神经压迫48h组(P0.01);脊神经结扎24h组DRG中HDAC6表达量显著低于马尾神经压迫24h组(P0.01);脊神经结扎48h组DRG中HDAC6表达量显著低于马尾神经压迫48h组(P0.01)。蛋白免疫印迹:脊神经结扎组在损伤24、48小时后NAT1,MEC-17表达量均高于马尾神经压迫组;Sirt2,HDAC6表达量均低于马尾神经压迫组。免疫荧光检测:脊神经结扎48h组DRG中NAT1表达量显著高于马尾神经压迫48h组(P0.01);脊神经结扎24h组DRG中MEC-17表达量显著高于马尾神经压迫24h组(P0.01);脊神经结扎24h组DRG中Sirt2表达量显著低于马尾神经压迫24h组(P0.01);脊神经结扎24h组DRG中HDAC6表达量显著低于马尾神经压迫24h组(P0.01);脊神经结扎48h组DRG中HDAC6表达量显著低于马尾神经压迫48h组(P0.05)3、术后7天分离提取每组大鼠相应节段(双侧L5、6)DRG组织,行TUNEL染色发现马尾神经压迫对照组细胞凋亡率较假手术组显著增多(P0.01);马尾神经压迫实验组细胞凋亡率较对照组明显减少(P0.05)。HE染色显示假手术组中马尾神经纤维致密有序,轴突无肿胀,髓鞘完整;马尾神经压迫对照组中马尾神经纤维松散,部分轴突及髓鞘肿胀,脱髓鞘改变;马尾神经压迫实验组中马尾神经纤维紧密,少量轴突肿胀、脱髓鞘改变。蛋白免疫印迹结果显示假手术组和马尾神经压迫对照组HDAC6表达量无显著差别;马尾神经压迫实验组HDAC6表达量明显低于对照组(P0.05)。免疫荧光检测显示假手术组和马尾神经压迫对照组HDAC6表达量无显著差别;马尾神经压迫实验组HDAC6表达量明显低于对照组(P0.05)。经甩尾试验检测,发现术后各个时间点马尾神经压迫对照组的大鼠甩尾反应潜伏期(TFL)较假手术组均显著延长(P0.01);但马尾神经压迫实验组术后TFL时间逐渐缩短,在术后第7天较对照组明显缩短(P0.05)。结论本马尾神经压迫损伤和相应节段脊神经结扎实验动物模型设计合理、稳定性高、易于操作、复制性强。能真实有效地模拟脊神经受压造成的DRG神经元外周支损伤和腰椎管狭窄造成的DRG神经元中枢支损伤的病理过程,为研究两者损伤后再生能力差别显著的内在原因奠定了实验基础。DRG神经元轴突的中枢支损伤后乙酰化酶的不足和去乙酰化酶水平较高可能是马尾神经损伤后再生困难的原因之一。HDAC6抑制剂(Tubastatin A)能有效降低大鼠马尾神经受损后DRG神经元内HDAC6含量,减少神经细胞凋亡和马尾神经轴突脱髓鞘改变,并能恢复部分神经功能。本实验尚局限于动物实验证明Tubastatin A具有对马尾神经损伤的治疗作用,而其具体的病理生理学、细胞学、免疫学机制及药理作用尚不明了,并且HDAC6在神经系统疾病过程中有着非常复杂的多重作用机制,这些都有待于进一步深入研究。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R651

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