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《第二军医大学》 2017年
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角质细胞中FOXO1基因对正常和糖尿病小鼠牙龈伤口愈合的影响

陆永健  
【摘要】:伤口愈合是有许多生物因子参与其中的一个复杂的生物学过程。同时,伤口愈合也与许多因素相关。其中伤口中血管生成是伤口愈合的关键因素之一。多种信号作用于内皮细胞(EC)后能够引起的血管生成,这个过程中受到许多因子的调控。在这些因子中,VEGF是最有效的血管生成因子之一。角质细胞和巨噬细胞是VEGF主要来源。FOXO1属于叉头转录因子的大家族,它参与体内的许多生物过程,包括细胞周期停滞,DNA修复,凋亡,抗氧化应激和葡萄糖代谢。我们实验室的近期研究表明,在角质细胞中特异性敲除FOXO1,能干扰正常皮肤和粘膜伤口中上皮形成。由于角质细胞是生长因子VEGF的主要来源,角质细胞中的FOXO1活性可能影响结缔组织愈合。此外,上皮-间质转化(EMT)是另一个可能影响结缔组织愈合的因素,此过程有助于胚胎发生,组织重塑,纤维化和转移性恶性肿瘤。它是一个受调控编排的系列事件,在此期间上皮细胞失去许多其上皮特异性特征并获得间充质细胞典型的特征。糖尿病是一个普遍的健康问题,它能产生很多相关的并发症,伤口愈合减缓是其中之一。其表现为炎症反应增强,肉芽组织形成受损,生长因子减少和血管生成受阻等,这些因素都是影响伤口愈合的重要因素,有些研究发现,在糖尿病伤口中敲除FOXO1能够挽救糖尿病对伤口愈合的负面影响,表现出促进了伤口中上皮再形成。所以,基于以上的这些观点。本实验的中心假设是,在角质细胞中特异性敲除FOXO1,能够显著影响正常和糖尿病患者牙龈结缔组织愈合,其过程与刺激血管生成和EMT介质的调节有关。本研究目的:1),研究正常和糖尿病小鼠牙龈上皮及结缔组织愈合情况,评估在角化细胞中特异性敲除FOXO1对伤口愈合的影响;2)在正常和糖尿病小鼠牙龈及结缔组织伤口愈合过程中,确定FOXO1是否参与调节角化细胞的活性,调节血管发生;3)评价特异性敲除FOXO1的角质细胞对正常和糖尿病牙龈及结缔组织伤口愈合过程中的上皮-间质转化(EMT)的影响。方法:体内实验:动物模型使用Cre-loxp技术,使KRT14.Cre小鼠和floxed FOXO1~(L/L)小鼠杂交后得到上皮角质细胞中特异敲除FOXO1基因实验小鼠:实验组(K14.Cre~+.Foxo1~(L/L))以及对照组(K14.Cre~-.Foxo1~(L/L))小鼠。对于EMT研究,使用他莫昔芬诱导的K14CreERT-ROSA26杂交小鼠。糖尿病小鼠模型使用STZ(50mg/kg)连续5天腹腔注射,诱导I型糖尿病。小鼠维持高血糖10天后进行牙龈创口手术。创口位于右侧第一磨牙近中邻面中上腭区牙龈,创口为直径为1毫米的全厚伤口。在创伤后的第4天,第7天处死小鼠,收取伤口样本。组织学样本,经固定,脱钙,切片后,用苏木精和曙红(HE)和Masson三色(MT)进行染色,对伤口样本的组织学形态进行测量。对于EMT研究,采用冰冻切片染色后行组织学形态进行测量;体内试验:分别用特异性抗体抗FOXO1,CD31,α-SMA,VEGFA和Ki67对组织的相应蛋白进行免疫荧光染色,使用荧光显微镜进行定量分析;使用TUNEL法和Ki67双染色方法对细胞组织内的细胞凋亡进行测量和分析研究。体外实验:用人类永生牙龈角质细胞(HIGK)和小鼠表皮角化细胞(MPEK),实验组与ON-TARGET plus SMART pool siRNA抗人FOXO1进行转染,对照组与siRNA(ON-TARGET plus Non-targeting Control Pool)进行转染,对细胞内的FOXO1和VEGF-A蛋白水平进行检测;在荧光素酶报告实验中,HIGK细胞和MPEK细胞在实验组中用FOXO1,FOXO1-AAA质粒进行转染,pCDNA3.1对照质粒作为对照质粒。转染后利用双荧光素酶报告基因检测VEGF-A报告子的活性。基因阵列分析,用正常人表皮角质细胞(NHEK)细胞在低糖(5mM d-glucose)和高糖(25 mM d-glucose)培养基中培养5天,用FOXO1或scrambled siRNA转染相应的细胞,然后,使用提取总RNA。采用基因芯片人类基因1.0 ST阵列进行RNA分析。结果:体内实验结果:实验组小鼠(K14.Cre~+.Foxo1~(L/L))与对照组小鼠(K14.Cre~-.Foxo1~(L/L))比较,上皮中的FOXO1表达降低,在结缔组织中则没有明显的差异;在正常血糖情况下,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠结缔组织愈合延迟,在第四天和第七天时结缔组边缘之间的间隙增加(P0.05);伤口中的肉芽组织和胶原产生均减少。但是在糖尿病组中,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)与K14.Cre~-.Foxo1~(L/L)小鼠没有明显的差异;K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)在结缔组织中成纤维细胞密度在血糖正常的伤口中降低56%(P0.05),但是在糖尿病伤口中,基因敲除或不敲除的结果相似,无明显差异。肌成纤维细胞对于伤口收缩和成熟的关键。在正常糖尿病的伤口中,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠肌成纤维细胞的数目减少57%(P0.05)),但在糖尿病伤口中肌成纤维细胞增加了50%(第4天)和28%(7天);在特性敲除角质细胞FOXO1对体内成纤维细胞增殖和凋亡实验中,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)血糖正常组小鼠成纤维细胞的增殖的百分比降低了68%(第4天)(P0.05),在糖尿病组中,增殖的成纤维细胞的百分比在第4天时相似,但在第7天时在K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠中增加2.7倍(P0.05);凋亡的成纤维细胞在第4天时,在FOXO1敲除血糖正常小鼠中增加3倍(P0.05);但在第7天,K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠糖尿病伤口中下降60%(P0.05)。此外,在K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠伤口上皮中,角质细胞增殖的53%的下降(P0.05,第4天);对于血管生成的研究,血糖正常小鼠K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠与K14.Cre~-.Foxo1 ~(L/L)相比,结缔组织内血管密度减少52%(第4天)和44%(第7天)(P0.05)。与此相反,在糖尿病组中K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠与K14.Cre~-.Foxo1 ~(L/L)血管密度没有显著的差异(P0.05)。在血糖正常组中,K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠Ki67和CD31双阳性增生细胞减少40%(第4天)和49%(第7天)(P0.05)。与此相反,K14.Cre~+.Foxo1~(L/L)小鼠在糖尿病组中没有表现出显著差异。内皮细胞(EC)凋亡的百分比在我们的研究中非常低。在研究角质细胞敲除FOXO1对血管生成的影响是通过VEGFA介导的,体外实验结果显示,在HIGK细胞中沉默FOXO1,VEGFA蛋白质水平在标准葡萄糖培养基中减少57%(P0.05);在体内实验中,K14.Cre~+.Foxo1 ~(L/L)小鼠正常血糖组中新生上皮中的VEGFA蛋白质水平也显著减少53%(第4天,P0.05)和42%(第7天,p值p0.1),但在糖尿病小鼠中对VEGFA水平的影响减小,无明显差异(P0.05);正常血糖小鼠结缔组织内VEGFA表达降低约58%(第4天,P0.05)52%(第7天,p0.05),在糖尿病小鼠的伤口中,无论在上皮还是结缔组织中,VEGFA表达水平在第4天时相似,但在第七天时。结缔组织中有小但显著的差异,增加了1.7倍(P0.05)。荧光酶素报告实验结果显示FOXO1(FOXO1AAA)过表达时,VEGFA启动子活性在HIGK细胞中增加2.4倍,在小鼠角化细胞(MPEK)中增加了3.3倍,而当FOXO1沉默时HIGK细胞中VEGFA启动子活性下降了20-43%(P0.05);上皮-间质转化(EMT)实验结果显示,在他莫昔芬激活的Cre重组酶介导的重组小鼠中,TdTomato有着强烈的表达。但是,在样本中没有观察到角化细胞的转分化成典型的成纤维细胞或肌成纤维细胞。结论:1.角质细胞特异性敲除FOXO1损害正常血糖小鼠结缔组织愈合,而在糖尿病小鼠中无显著差异;2.角质细胞中特异性敲除FOXO1影响正常血糖小鼠的新血管形成,而在糖尿病小鼠中没有显著差异;角化细胞中的FOXO1通过调节VEGFA对血管生成产生影响;3.在上皮-间质转化(EMT)中,未发现角化细胞转分化成典型的成纤维细胞或肌成纤维细胞的证据。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R587.1;R641

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