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《第二军医大学》 2017年
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针刺干预内质网应激调节脑缺血再灌注大鼠神经细胞自噬的机制研究

舒适  
【摘要】:研究背景脑卒中已经成为我国城市和农村居民疾病主要死亡原因的第一位。脑缺血再灌注损伤直接影响脑血管病的预后转归,如何积极减轻脑缺血再灌注损伤是防治脑缺血性疾病的关键。自噬作为新的程序性细胞死亡方式,在细胞“存活”与“毁灭”切换中的意义重大。在脑缺血缺氧应激条件下,自噬能够清除神经细胞内衰老细胞器及错误折叠蛋白、维持细胞存活和细胞的能量稳态,是一种重要的物质代谢活动。若过度上调,则导致细胞死亡。因此,研究神经细胞自噬及其调节机理为进一步深入探寻新的细胞“存活”和“死亡”调控机制提供了契机。新近研究表明,内质网应激中非折叠蛋白质反应(UPR)是诱导细胞自噬的重要信号通路。UPR信号通路被激活后,内质网内的未折叠蛋白使得GRP78释放PERK/elF2α、Ire1/TRAF2、ATF6α,共同调控下游CHOP,而CHOP转录调控抑制抗凋亡蛋白BCL-2,最终通过诱导自噬相关蛋白Beclin-1表达来影响自噬。基于这一新的科学发现,我们推测针刺减轻脑缺血再灌注损伤可能与启动内质网应激UPR三条信号转导通路调控CHOP来诱导细胞自噬过程密切相关。本研究的开展是将有助于进一步揭示脑缺血再灌注损伤的病理机制与防治规律,进而为针刺减轻脑缺血再灌注损伤提供客观的实验依据,具有重要的科学意义与良好的运用前景。研究目的动态观察针刺水沟穴对脑缺血再灌注损伤后内质网应激UPR信号转导通路诱导自噬性程序性细胞死亡的影响,从内质网应激UPR三条信号转导通路PERK/elF2 α、Ire1/TRAF2、ATF6α的分子作用途径深入阐释脑缺血再灌注损伤后自噬性程序性细胞死亡的作用机制以及针刺水沟穴减轻脑缺血再灌注损伤可能物质基础与有效作用靶点,为针刺治疗脑缺血的临床应用提供实验与理论依据。研究方法本研究共分为四个部分:一、动态观察针刺减轻大鼠脑缺血再灌注损伤的疗效观察参照Longa线栓法并改良,制作大鼠大脑中动脉栓塞局灶性缺血再灌注模型(MCAO/R)。并按照随机数字表方法将实验大鼠随机分成3组,分别为假手术组、模型组、治疗组(n=15)。其中模型组与治疗组根据时相进一步分为6h、24h、72h3个亚组。采用Bederson神经功能缺损体征评分法进行神经缺损体征测评,TTC染色观察脑梗死区域变化情况,光镜观察缺血区组织形态学变化情况。二、动态观察针刺对大鼠脑缺血再灌注后细胞自噬的影响造模同上,并按照随机数字表方法将实验大鼠随机分成3组,分别为假手术组、模型组、治疗组(n=4)。其中模型组与治疗组根据时相进一步分为6h、24h、72h3个亚组。采用透射电镜观察神经细胞自噬体情况;Western blot法检测各组大鼠自噬相关蛋白Beclin-1、LC3的表达。三、检测针刺对大鼠脑缺血再灌注灶周脑组织内质网应激的影响造模同上,并按照随机数字表方法将实验大鼠随机分成3组,分别为假手术组、模型组、治疗组(n=4)。其中模型组与治疗组根据时相进一步分为6h、24h、72h3个亚组。Western blot法检测各组大鼠内质网应激相关蛋白GRP78和CHOP的表达,以及内质网应激UPR通路相关蛋白PERK、p-eIF2α、IRE1α的表达。四、内质网应激(ERS)调节自噬的作用机制及针刺干预作用根据GRP78的基因序列,我们设计三种干扰shRNA-GRP78目的基因片段,并在此基础上,构建了三种不同的干扰慢病毒。同时,构架了过表达CHOP基因的慢病毒载体LV-CHOP。在确定慢病毒载体包装成功,且滴度正常后,对所构建的干扰慢病毒载体LV-shRNA-GRP78以及过表达慢病毒载体LV-CHOP进行了体外的鉴定。鉴定方法为:使用LV-shRNA-GRP78、LV-CHOP分别感染BRL细胞,qPCR方法判断GRP78、CHOP的基因的表达情况。确定的干扰效果最佳的LV-shRNA-GRP78和过表达的LV-CHOP注射大鼠脑皮质。继续饲养4天待病毒在体转染稳定后,通过参照Longa法并改良,制作脑缺血再灌注损伤的模型。同时针刺水沟穴。1天后,分离大鼠脑皮质,进行qPCR分析。评估大鼠脑皮质GRP78和CHOP的mRNA的改变情况。最后用Western blot法检测慢病毒载体联合针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织自噬相关蛋白Beclin-1表达情况。结果一、针刺对脑缺血再灌注(MCAO/R)大鼠的治疗作用(一)MCAO/R大鼠脑梗死区域变化情况:各组大鼠脑组织经TTC染色结果显示假手术组脑组织全部呈玫瑰红色,而模型组和治疗组大鼠各时相均有明显白色梗死区域,且白色梗死区域随时间增加而体积增大。各时相的治疗组大鼠的白色梗死区域相较于同时相模型组均减小。24h和72h时相治疗组相较于模型组大鼠脑梗死体积减小最为明显。(二)MCAO/R大鼠神经功能恢复的影响:假手术组大鼠未出现神经功能缺损体征,模型组大鼠神经则有明显神经功能缺失,模型组相较于同时相的假手术组有明显差异(p0.01);电针组的大鼠神经功能缺损评分较模型组明显降低,再灌注后6h未见统计学差异(p0.05),再灌注后24h和72h具有明显统计学差异(p0.05)。(三)光镜观察脑缺血再灌注后脑组织形态学变化:假手术组神经细胞染色均匀,轮廓清楚,无水肿。模型组神经细胞数量减少,细胞层次欠清晰;神经细胞肿胀,排列紊乱;胞浆淡染。治疗组神经细胞肿胀,数量减少;较之于模型组24h、72h后神经细胞肿胀有所减轻,神经元结构有所恢复。二、动态观察针刺对大鼠脑缺血再灌注后细胞自噬的影响(一)电镜观察脑缺血再灌注区组织超微结构变化:模型6h组神经髓鞘损伤,染色质分布正常,线粒体肿胀,内质网轻度扩张,可见自噬泡形成;模型24h组可见多个自噬泡;模型72h组未见自噬体或溶酶体。治疗组针刺各时间段可见自噬泡均少于模型组。(二)针刺水沟穴对MCAO/R大鼠自噬相关蛋白Beclin-1、LC3表达的影响:模型组各时相Beclin-1蛋白的相对表达量相较于假手术组明显升高,差异有统计学意义(p0.05);治疗组各时相Beclin-1蛋白的相对表达量相较于同时相的模型组均降低,再灌注后24h和72h差异有统计学意义(p0.05)。模型各组LC3-II/LC3-I比值相较于假手术组升高明显(p0.05)。治疗6h组LC3-II/LC3-I比值较于同时相的模型组降低,差异有统计学意义(p0.05)。三、动态检测针刺对MCAO/R大鼠灶周脑组织内质网应激的影响(一)Western blot显示大鼠脑缺血再灌注后内质网应激模型各时相GRP78蛋白的表达上调,再灌注6h达到峰值。与假手术组相比具有明显统计学意义(p0.01)。针刺治疗后GRP78蛋白6h表达下降明显,与同时相模型组比较差异具有统计学意义(p0.05)。再灌注24h、72h则较同时相模型组出现上调,24h两组间差异具有统计学意义(p0.05)。模型组各时相CHOP表达均明显上调,24h达到峰值(p0.01)。治疗组CHOP蛋白表达较同时相模型组降低,24h、72h两组间差异具有统计学意义(p0.01)。(二)大鼠缺血再灌注24h后PERK、p-e IF2α蛋白的表达均明显上调(p0.01),而治疗组PERK、p-eIF2α蛋白较模型组表达显著降低(p0.01)。模型24h组Ire1 蛋白表达增高,而针刺治疗24h组的Ire1蛋白与模型24h组表达出现下调(p0.05)。四、内质网应激(UPR)调节自噬的作用机制及针刺干预作用(一)我们设计了三种干扰shRNA-GRP78目的基因片段,并在此基础上,构建了三种不同的干扰慢病毒LV-shRNA-GRP78-581、LV-shRNA-GRP78-1098、LV-shRNA-GRP78-1852。同时,我们构架了过表达CHOP基因的慢病毒载体LV-CHOP。计算得到LV-shRNA-GRP78-581、LV-shRNA-GRP78-1098、LV-shRNA-GRP78-1852和LV-CHOP的病毒滴度分别为2.0×10~8、1.8×10~8、1.6×10~8和2.0×10~8 TU/ml。(二)对我们所构建的干扰慢病毒载体LV-sh RNA-GRP78以及过表达慢病毒载体LV-CHOP进行了体外的鉴定。1.构建的三种LV-shRNA-GRP78载体,即LV-shRNA-GRP78-581、LV-shRNA-GRP78-1098、LV-shRNA-GRP78-1852,感染BRL细胞,进行qPCR分析GRP78mRNA水平的改变情况。结果显示:感染BRL细胞后,细胞内的GRP78平均mRNA水平均明显低于无关序列的病毒组(p0.01,p0.01,p0.01);且LV-shRNA-GRP78-581感染后的BRL细胞内的GRP78mRNA水平明显低于LV-shRNA-GRP78-1098(p0.01)、LV-shRNA-GRP78-1852(p0.01)。2.使用构建LV-shRNA-GRP78,以及空白的LV感染BRL细胞,以CHOP蛋白为靶基因,β-actin作为内参标记物,进行qPCR分析CHOP mRNA水平的改变情况。结果显示LV-CHOP感染BRL细胞后,细胞内的CHOP平均mRNA水平明显高于对照的无关序列的病毒组(p0.01)。(三)将确定的干扰效果最佳的LV-shRNA-GRP78-581和过表达病毒LV-CHOP注射大鼠脑皮质。qPCR分析结果所示单独局部注射LV-shRNA-GRP78、局部注射LV-shRNA-GRP78联合治疗组的大鼠脑皮质内的GRP78mRNA与正常组大鼠之间无明显差异(p0.05)。此外,在模型组大鼠中,单独局部注射LV-shRNA-GRP78与局部注射LV-shRNA-GRP78联合治疗组的大鼠脑皮质内的GRP78含量之间也无明显差异(p0.05)。因此,LV-shRNA-GRP78-581在活体大鼠皮质内局部注射转染效果不佳。在模型大鼠上进行针刺后,大鼠脑皮质的CHOPmRNA含量较模型组明显降低(p0.01);对模型组大鼠脑皮质局部注射过表达病毒LV-CHOP后,脑皮质内CHOP mRNA含量较模型组显著增加(p0.01);对注射过LV-CHOP病毒的模型大鼠,进行针刺后,脑皮质内的CHOP mRNA较注射过LV-CHOP病毒的模型大鼠含量明显下降(p0.05),但仍然高于单纯的模型组(p0.05)。(四)用Western blot法检测慢病毒载体LV-CHOP联合针刺对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织自噬相关蛋白Beclin-1表达情况。结果显示模型大鼠上进行针刺后,大鼠脑皮质Beclin-1蛋白表达出现减少,统计学差异显著(p0.01);对模型组大鼠脑皮质局部注射过表达病毒LV-CHOP后,脑皮质内CHOP mRNA含量较模型组显著增加(p0.05);在过表达病毒注射的模型组基础上再进行针刺,Beclin-1蛋白表达较于单纯过表达病毒注射的模型组出现减少,较于与单纯治疗组则出现过表达增多,差异有统计学意义(p0.01,p0.05)。结论1.电针水沟穴能够促进脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能恢复,对大鼠脑缺血再灌注损伤有着明确的治疗作用。2.电针水沟穴对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗作用机制可能与抑制Beclin-l、LC3表达,下调神经细胞自噬水平密切相关。3.电针水沟穴可能通过上调GRP78,干预UPR中PERK/e IF2α和IRE1通路,抑制CHOP表达水平来影响内质网应激。4.内质网应激CHOP通路调控Beclin-l表达,抑制过度自噬是针刺水沟穴减轻脑组织缺血再灌注损伤的重要环节。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R245

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