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《第二军医大学》 2017年
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锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层与宿主骨整合的作用及机制研究

余将明  
【摘要】:研究目的:虽然当前临床上骨植入体植入成功率颇高,但是仍然存在植入体植入体内后失败的问题,尤其在骨质疏松患者中。已有研究证实Zn/Ca摩尔比率为0.5的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层相对于硅酸钙陶瓷等涂层,其促进MC3T3-E1细胞的生物学作用更强,提示该涂层对骨整合效应产生重要作用。骨质疏松是临床中常见的基础疾病,是骨植入体植入失败的重要因素之一。探索出对于骨整合具有最优生物学活性的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层,并研究其对于骨质疏松模型的骨整合作用及作用机制显得迫在眉睫,其能否作为更加优良的骨植入体涂层运用于临床,我们将进一步探索并奠定理论基础。研究内容:(1)构建并优化锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层。采用溶胶-凝胶法并调节锌钙离子的比率,构建Zn/Ca比率分别为0.1、0.3、0.5的锌掺杂硅酸钙陶瓷粉体,并使用APS系统将其均匀喷涂在钛片上,在预制参数下制备锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层,检测涂层表面形貌、内部显微结构、化学稳定性及与钛基底材料的结合强度等。(2)研究锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层对前成骨细胞MC3T3-E1及破骨细胞RAW264.3的生物学作用。我们将把前成骨细胞(MC3T3-E1)和破骨细胞(RAW264.7)培养在不同Zn/Ca比率的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层表面,研究比较它们的生物学响应,探索锌掺杂硅酸钙涂层中的最佳Zn/Ca比率,和从涂层中缓慢释放的Zn离子促进成骨分化和抑制破骨细胞分化的情况。(3)构建骨质疏松兔模型,并研究锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层钛棒对正常新西兰兔以及该骨质疏松模型骨整合作用的影响。通过micro-CT扫描和硬组织切片染色的方法检测植入体周围新骨形成和骨量增长情况,比较对照组和实验组之间的骨植入体界面和植入体周边骨组织小梁微观结构的差异。(4)观察不同Zn/Ca比率的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层对骨髓间充质干细胞(BMSCs)的生物学响应,研究锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层促进骨整合的作用机制。我们将从SD大鼠中提取BMSCs并进行培养鉴定,使用化学方法、ELISA、qRT-PCR等多种方法研究BMSCs在钛合金金属片、HA(羟基磷灰石)陶瓷涂层、Ca SiO_3陶瓷涂层钛片、Zn/Ca比率分别为0.1、0.3的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层钛片表面的增殖、成骨分化情况,成骨指标例如ALP,COL-I,OCN和RUNX2。而且,锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层促进成骨分化和骨再生的机制尚不知晓。为了进一步研究潜在的分子机制,我们探索与不同涂层上BMSCs成骨分化的信号通路相关的潜在靶基因。相关研究已证明TGF-β途径在BMSC分化为成骨和软骨形成谱系中起重要作用,TGF-β通过激活它们的受体以诱导一组细胞内转录因子的磷酸化而对骨形成起作用,称为Smads。Smad2/3作为TGF-β受体的底物。然后活化的Smad复合物可以移动到细胞核中以触发一组靶基因的转录。我们将通过qRT-PCR和Western-Blot方法检测TGF-β/Smad信号通路的相关基因如TGF-β1,Smad2和Smad3,以及经典MAPK信号通路的基因表达的变化,包括IGF-I,ERK 1/2和PKC-δ。TGF-β抑制剂SB431542也将被用于研究TGF-β信号在BMSCs分化过程中对不同涂层的直接作用。结果:(一)成功制备了Zn/Ca比率分别为0.1、0.3、0.5的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层,这三组涂层的表面形貌均较为粗糙,内部显微结构均为典型陶瓷的晶体结构,与钛基的结合强度均明显强于CaSiO_3陶瓷涂层,亲水性均与Ca Si O_3陶瓷涂层相当,明显优于纯钛金属片,均能缓慢释放Zn离子,且Zn离子浓度随着Zn/Ca比率的升高而升高,在7d后逐渐趋于饱和。(二)Zn/Ca比率为0.3的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层,对前成骨细胞MC3T3-E1细胞显示出最高的促进细胞活力作用,并且显著促进其成骨分化,上调ALP,COL-1和OCN等成骨指标基因,对破骨细胞RAW 264.7细胞显示出了最低的细胞活力作用,并显著抑制了破骨细胞基因OAR,TRAP和HYA1的表达,因此该涂层同时具有促进成骨细胞和抑制破骨细胞的作用,对成骨细胞和破骨细胞之间形成动态平衡以促进骨整合作用拥有最佳效果。(三)成功构建了骨质疏松兔模型,该模型比正常新西兰兔的骨量和骨密度均明显减少。锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层在植入正常成熟新西兰兔股骨后显示出了良好的生物相容性和促成骨作用。Micro-CT扫描分析结果显示,锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层相比未涂层钛棒、HA陶瓷涂层、CaSiO_3陶瓷涂层对骨质疏松兔模型具有更好的促进骨质生长和骨整合的作用,其中Zn/Ca比率为0.3的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层效果最佳,同时组织病理学分析结果显示,该涂层相比其他涂层而言,在骨质疏松兔模型中能够更好促进骨界面新骨形成,其中Zn/Ca比率为0.3的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层效果最佳。(四)锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层在体外可以显著促进BMSCs的增殖和成骨分化,显著升高成骨特异性基因ALP,Col-1,OCN和RUNX-2m RNA的表达,提高ALP活性,增加COL-I,OCN的分泌以及钙沉积,具有明显的剂量或时间依赖性趋势,其中促BMSCs活性最佳的涂层是Zn/Ca比率为0.3的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层。证实了锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层通过激活TGF-β/Smad信号通路以调节BMSCs的成骨分化,同时证实了在MAPK/ERK信号通路在该过程中未被激活。结论:不同Zn/Ca摩尔比率的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层的表面形貌相似,均具有典型陶瓷晶体的内部显微结构,优良的亲水性,以及缓慢释放作为生物活性离子Zn离子的能力。Zn/Ca比率为0.3的锌掺杂硅酸钙陶瓷涂层,无论是促进前成骨细胞MC3T3-E1细胞的生物学活性和成骨分化能力,还是抑制破骨细胞RAW 264.7细胞的生物学活性和破骨基因的表达,都显示出了最佳的效果,良好调节了成骨细胞/破骨细胞之间动态平衡。在植入成功构建的骨质疏松兔模型后,该涂层同样显示出了最优的促进骨界面新骨形成、骨质生长和骨整合作用。同时,该涂层在体外促进BMSCs的增殖、成骨分化和矿化过程中也显示出了最优效果,并证实了其通过激活TGF-β/Smad信号通路起到相应细胞生物学活性作用,MAPK/ERK信号通路在该过程中未被激活。
【学位授予单位】:第二军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R687.3;R318.08

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