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《军医进修学院》 2001年
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人TIMP-1基因克隆、体外肾脏细胞基因转导、转基因小鼠建立及其肾脏表型变化

林洪丽  
【摘要】:肾脏细胞外基质(Extracellular metrix,ECM)合成和降解及肾脏固有细 胞增殖、分化和凋亡在肾脏的正常发育和肾脏疾病的发生和发展中有着重 要的作用。金属蛋白酶组织抑制剂-l(tissue inhibitor metalloproteinase-1,TIMP-l)是基质金属蛋白酶抑制剂家族的主要成份, 可以通过抑制基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)的活性 而阻断其对 ECM的降解作用,引起 ECM的积聚,在脏器纤维化过程中有重要 的作用。此外,晚近的研究表明:TIMP-1除了上述抑制细胞外基质降解的 功能外,还参与某些细胞的增殖、分化和凋亡,因止TIMP-1被认为是一个 多功能因子,本研究旨在通过基因转导技术进一步探讨TIMP-1抑制肾脏 ECM降解的作用,以及除此之外,TIMP-1在肾脏是否存在新的功能。 根据Genebank中TIMP-1基因的碱基序列,用RT-PCR的方法从人的正 常肾组织中克隆出了包含信号肽密码在内的TIMP-1全长cDNA序列。采用 T-A克隆的方法将之插入pCRR2.1中间载体,DNA测序证实该片段序列与文 献报告的完全一致。利用亚克隆的方法将 TIMP-l cDNA片段克隆到 pCDNA3 载体上,构建出正义及反义TIMP-1重组真核表达载体pCDNA3/TIMP-1和 pCDNA3/ATIMP-1,通过脂质体 DOTAP将 pCDNA3/TIMP-l转染至 COS-7细胞, Northern及原位杂交证实在 COS-7细胞上获得人 TIMP-1的高效表达,细胞 增殖实验表明TIMP-1的高效表达可促进COS-7细胞的增殖。 构建表达正义及反义 TIMP-1的逆转录病毒载体,经 PA317细胞包装后 获得病毒上清,测定滴度后以之感染大鼠肾卜球系膜细胞,Northern杂交 证实了正、反义TI肝<在大鼠系膜细胞上可以高效表达,在基因水平上实 现了 TIMP-1的高表达或低表达。实验结果表明:转染正义的TIMP-1基因 后,系膜细胞的ECM成分FN和IV型胶原的蛋白质水平的表达明显增高,与 之相反,转染反义的TIMP-1基因后,系膜细胞的ECM成分刚和w型胶原 的蛋白质水平的表达明显减低,但上述系膜细胞FN和IV型胶原的mRNA水 平均没有变化,说明TIMP-1在系膜细胞上的过表达抑制了FN和IV型胶原 的降解,转染及义 TIMP-1基因引起大鼠内源性 TIMP-1下调,导致了刚和 二 型胶原的降解增加。反义HMP一工基因这种促进大鼠系膜细胞脱M降解的 作用,即从分子水平反证了TIMPl抑制肾脏ECM降解的作用,同时也为利 用逆转录病毒载体介导反义TIMPJ在体内进行某些肾脏疾病治疗研究提供 一定的实验基础。 将正义及反义TIMP-1 的重组真核表达载体PCDNA3-TIMP-1 和 pCDNA3咕 < 转染至大鼠的肾*、球系膜细胞中,Northern 杂交及 We s t ern杂交证实了x、反义TIMP人在大鼠系膜细胞Lv以高效表达。t 血清诱导大鼠系膜细胞凋亡,利用TUNEL染色、DNA片段分析技术在无血清 后的不同时间点检测细胞凋亡,结果表明转染反义TIMP-1基因的大鼠系膜 细胞于无血清1卜小时即开始发生凋亡;无外源基因转染及空载体转染的大 鼠系膜ic胞在无血清 48,J、时发生凋亡;而转染正义 TIMP-1基因的大鼠系 膜细胞在无血清4天时才开始发生凋亡。Northern杂交结果表明 TIMP-1 可抑制大鼠系膜细胞 bax的表达,但并不影响比 1《的表达。这一结果提 示了HMP司在肾脏除了抑制ECM降解作用外还具有抑制体外培养的大鼠系 膜细胞的凋亡的新功能。TIMP-1对大鼠系膜细胞凋亡的作用可能部分是通 过对bax表达的抑制作用来完成的。 为了进一步在整体水平上探讨原发的TIMP-1高表达对肾脏的影响。我 — —R.86MX68——&qd#①—— 们通过显微注射的方法建立了TIMP-1转基因,J、鼠,Southern杂交和PCR 产物测序证实了外源的人TIMP-1基因稳定整合到。J、鼠的染色体上并遗传给 后代。免疫组化结果证实了外源的人 TIMP-1在肾脏获得表达。该小鼠的成 功制备及目的基因在肾脏获得表达为进一步在整体水平研究 TI MP刁在肾脏 中的作用提供了良好的模型。 我{fi观察到**P八。J、鼠肾脏的发育较正常,J、鼠更为成熟,肾,J、球数目 及肾小球平均面积增加,肾小球成熟指数升高。肾脏增殖细胞核抗原 (proliferating cell nuclear antigen,PCNA)的表达较正常*。鼠为低。 进一步检测在肾脏发育中有关键作用的血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和它的酪氨酸激酶受体Fib 一1的表达, 结果表明 VEGF及其受体 FIk叫表达的上调。我们的初步研究结果表明, TIMP-1在肾脏的局部高表达可以上调VEGF和Fib-1在肾脏的表达,TIMP-1 可能参与肾脏的发育。 总之,我们利用体外基因转导和转基因动物技术,在分子、细胞和动 物整体三个层次上探讨了正义及反义TIMPI对’肾脏的细胞外基质、肾1、球 系膜细胞凋亡和肾*、球发育的影响及初步机制,阐述了*mP八在肾脏新的 作用并为之提供了更为直接的证据。
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