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《中国人民解放军军医进修学院》 2002年
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H-2半相合小鼠CD34~+细胞混合TK基因转染的TK~+T细胞移植模型中治疗GVHD及其GVL效应的实验研究

刘希民  
【摘要】: 异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)取得了很大成就,但仍有许多患者因为无合适供者而失去移植机会。HLA半相合移植可使更多的患者得到移植的机会,但因为HLA半相合移植后GVHD的发生率和死亡率均很高,严重限制了其临床应用。HLA半相合CD34~+细胞移植扩大了供者来源,而且因为纯化的CD34~+细胞中T细胞减少4~5个数量级,移植物抗宿主病(GVHD)发生率和严重程度都大为降低;移植后免疫抑制剂的应用减少和对肝、肺等器官毒性减轻,使早期移植相关死亡率下降。但去除T细胞削弱了移植物抗白血病(GVL)效应导致移植后复发率增高、移植失败的可能性增加、患者细胞免疫功能严重低下易出现致命感染。结果患者生存率与非去T移植相比并无提高。因此,如何在HLA半相合CD34~+细胞移植中保留T细胞的治疗作用并消除其副作用,是目前迫切需要解决的问题。 将TK基因(自杀基因)体外转染供者T细胞成为TK~+T细胞,然后和CD34~+细胞混合移植,一旦发生GVHD,则给予特异性药物丙氧鸟苷治疗,选择性杀死引起GVHD的TK~+T细胞,使GVHD得到控制,同时又可保留T细胞的治疗作用。这样,HLA半相合CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植既能保留该移植方法的优点,又能克服其不足。根据这一设想,本文进行H-2半相合小鼠CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植的实验研究,为HLA半相合CD34~+细胞和TK~+T细胞混合移植的临床应用奠定基础。 目的 建立H-2半相合CD34~+细胞及TK~+T细胞混合移植GVHD模型和GCV治疗GVHD模型;观察H-2半相合CD34~+细胞及TK~+T细胞混合移植的GVL效应。为临床HLA半相合TK~+T细胞和CD34~+细胞混合移植提供实验依据。 解放军总医院军医进修学院 博士学位论文 方法 1.提高逆转录病毒载体滴度 包装细胞GP+E86 经120urn加 的衣霉素 (tunicamycin)处理18小时后,再用预先收集的病毒上清转染、G418筛选 后,收集病毒上清测定滴度。 2.转染方法的选择 测定共培养法、离心法、脂质体一病毒混合法和标准法 等4种转染方法转染率,选择一种操作简便且转染率较高的转染方法。 3.建立混合移植 GVHD模型 以亲代 C57BL/6(H-2‘,8)为供鼠,Blab/c X C57BL/6 CB6FI(H一 2‘’‘,Y)为受鼠,移植前 4~6小时”CO 9.OGy全 身致死量照射。mIL-2和 ConA刺激供鼠脾脏T细胞增殖、转染 TK基因。 的18筛选及扩增:兔疫磁珠法从供鼠骨髓分离*的细胞,两者混合后移 植受鼠。 4.建立“V治疗混合移植GVHD模型移植后0天或7天给予“V治疗,剂 量均为 50mg-‘.kg-‘.dX7,腹腔注射。GCV治疗组与对照组比较并比较 2种 GCV应用方法的疗效。 5.观察混合移植WL效应静脉接种CB6FI /J’鼠EL96ll红白血病细胞,建 立“6n红白血病模型;以红白血病m6n(早)为受鼠,“mU6(8) 为供鼠,移植方法同上,移植后7天给予GCV治疗GVHD,观察GVL效应。 结果 1.包装细胞 GP+E86 经衣霉素处理后,应用 NIH3T3 测定病毒滴度为 6 X 10’cfu/ml,衣霉素处理前病毒滴度是 3.SX 10’cfu/。l。 2.共培养法、离心法、脂质体一病毒混合法和标准法的转染率分别是 32.33%士2.12%、18,72%士2.97%、9.43%士1.81%及6.64%士1.37%。离心法 转染率虽较共培养法低,但操作简便且无包装细胞污染,实验中采用这种 转染方法。 3.建立的混合移植模型经症状和病理检查100%发生急性GVHD。GVHD死亡 4 解放军总医院军医进修学院 搏士学位论文 时间集中在移植后 2~3周。TK“T细胞和 T细胞诱导 GVHD的能力无差别。 4.GCV治疗组小鼠生存时间较对照组明显延长,P<0.of。移植后 7天和 0 天给予GCV,小鼠生存时间分别为40.5士8.4天及26.6士4.8天,P<0.05, 表明移植后7天给予GCV疗效较好。 5.成功建立红白血病EL96ll CB6FI模型接种10’白血病细胞,CB6FI小鼠即 可发病。在白血病细胞 10’~10’之间,接种细胞数量和发病时间呈负相关 (r=-0.91)。混合移植组和化疗组红白血病CB6FI/J’鼠平均生存时间分别为 45.6士7.5天和30.5士5.2天,P<0.01,表明混合移植具有WL效应。 小结 1.应用衣霉素处理包装细胞GP十E86后,逆转录病毒载体滴度提高15倍。 2.建立了 H-2半相合 CD34”细胞和 TK”T细胞混合移植的急性 GVHD模型。 以往进行GCV泊疗H-2半相合小鼠急性GVHD的研究中,急性GVHD模型的 建立采用供鼠骨髓单个核细胞和 TK\细胞移植。我们利用纯化的 CD34”细 胞代替骨髓单个核细胞混合TK\细胞移植。这种移植模
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R457

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【参考文献】
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