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《中国人民解放军军医进修学院》 2003年
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转基因组织工程骨软骨复合体修复兔膝关节软骨全厚缺损的实验研究

张东  
【摘要】: 研究背景:关节软骨创伤或退变是骨科常见病患。软骨细胞属终末分化细胞,包被在基质陷窝中,缺乏增值和迁移能力。不超过软骨本身厚度的病损依靠软骨细胞有限的分裂能力,仅有极微弱的内源性修复或难以修复;穿透软骨下骨的缺损,由来源于骨髓的间充质干细胞分化为成软骨组织即外源性修复。近年来探索多种方法修复软骨损伤,如关节微创手术,自体或异体组织(骨膜、软骨膜、骨软骨块)移植、细胞移植(软骨细胞或间充质干细胞)移植等。诸多尝试说明在接受关节置换之前尚无公认的有效手段。组织工程技术可以通过获取自体少量组织细胞,经体外培养扩增后与支架材料复合,构建与病损区形状结构、生物学特性相近的细胞-支架复合体,以修复或替代损伤组织。用不同来源的细胞在高分子聚合物支架上培养,可以形成骨、软骨、肌腱等指骨小关节组织。以自体来源的同类组织修复软骨损伤存在供区有限、数量不足的问题。干细胞尤其是骨髓来源干细胞的研究促进了组织工程在骨关节领域的发展。利用干细胞的自我增值和多向分化潜能,用自体组织来源的干细胞经体外诱导后,可以在不同支架的材料上形成骨和软骨。本实验旨在研究利用干细胞多向分化潜能,将骨髓来源的间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells MSC)体外使用向成软骨方向分化诱导的条件培养液,或以重组缺陷型腺病毒为载体,携带人多向肝细胞生长因子cDSA(adHGF)转染MSC,与特制的高分子聚合物(PLGA)支架材料复合,构建组织工程小型骨软骨复合体,观察植入动物体内修复骨软骨缺损的转归。 方法:密度梯度离心法获得5月龄兔骨髓来源间充质干细胞,37℃,5%CO_2孵箱培养。经体外扩增传代后,给予不同处理:(1)DMEM培养液常规培养。(2)向成软骨方向诱导分化条件培养液培养(含TGF-β1 10ng/ml,bFGF 25ng/ml,地塞米松10~(-7)M),简称诱导组。(3)重组缺陷型腺病毒携带 博士学位论文 军医进修学院 多向肝细胞生长因子 cDNA佃dHGF)转染,简称转基因组.(4)条件培养液诱 导后adHGF转染,简称基因加诱导组.以自身兔关节软骨细胞为阳性对照组。 相差显微镜观察各组细胞形态特征.MTT法测定各组细胞增谊力.流式细胞 仪检羽adGFP转染率.ELISA检测adHGF转染帖C后皿F的表达.免疫组化 检测各组细胞1、11型胶原染色.紫外分光仪检测细胞培养上清液中氨基己 糖多糖(GAG)中的硫酸软骨素含量。RT-PCR检测各组细胞 I、11型胶原的 表达。扫描电镜观察MSC在PLGA支架上锚附、分布情况。将各处理组细胞 与PLGA复合体植入裸鼠背部皮下,3周后取材,进行大体观察、组织学检 查和1、11型胶原免疫组化染色,检测异位成软骨能力。取兔自体骨髓分离 培养MSC,按四个处理组方法,体外培养种子细胞,与PLGA支架构建直径 3.5。、高3。小型骨软骨复合体,植入股骨氏骸骨滑车处直径3.5。、 深3-4。同比例缺损区,自体骨软骨块移植为对照组,分别于4、8、16、 24周取材,进行大体观察、组织学检查和病理评分. 结果:应用密度梯度离心方法获得兔骨髓问充质干细胞(MSC八细胞传 5代后在聚集培养状态和向成软骨分化诱导组均可检测出诱导成软骨活性, 11型胶原免疫组化染色阳性,RT干CR可见表达 11型胶原条带,培养液上清 中GAG含量高于单层培养MSC组,低于关节软骨细胞组.流式细胞仪检测 adGFP转染地C转染率为 70.94%。adHGF转染后也表现成软骨现象,免疫 组化及 RT干CR均见* 型胶原.ELISA检测 adHGF转染mC可在四周内持续 稳定表达HGF。扫描电镜观察MSC在PLGA支架动附生长良好,孔隙深处可 民 见细胞分布。裸鼠背部皮下植入PLGA与不同处理MSC复合体,诱导组、转 基因组、基因加诱导组和软骨细胞组标本蓄红花0染色可见细胞及细胞外基 质呈亮红色;I型胶原免疫组化结果MSC各组均阳性,软骨细胞组阴性;11 型胶原免疫组化结果诱导组、转基因组、基因加诱导组、软骨细胞组均阳性. 单纯PLGA支架植入仅见成纤维细胞包裹,未见成骨或成软骨迹象.组织工 程骨软骨复合体修复兔膝关节软骨缺损,6个月时诱导组、转基因组和基因 4 博士学位论文 军医进修学院 加诱导组在大体观察上接近自体骨软骨移植,组织学检查见软骨下骨愈合良 好,浅表层形成类关节透明软骨组织(三组分别占 4儿,2/6和 2/4)、优 于未处理MSC组、单纯支架和缺损旷置组。组织学评分转基因加诱导组优于 单诱导组,显示转基因后具有增强软骨组织工程的潜能. 结论:兔骨说来源MSC在体外传代培养后,仍然保持干细胞自我增殖和 多向分化能力,在聚集培养状态、条件培养液诱导或adHGF转染后,MSC表 现程度不同的成软骨能力。MSC可在基于细胞的软骨修复中作
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R681.3

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