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《中国人民解放军军医进修学院》 2002年
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小剂量电离辐射下细胞表面膜受体EGFR和相关信号传导途径MAPK的放射生物学效应

关志伟  
【摘要】: 放射免疫治疗在实体瘤治疗中的疗效还不理想,我们提出的多次小剂量RIT与传统的单次大剂量RIT比较,疗效有所改善。相关研究和我们的前期实验显示低剂量和低剂量率照射模式,有其独特的放射生物学特点。以往的放射生物学多偏重于DNA这一靶点,而忽视了细胞膜在电离辐射中的作用。因此我们此次的实验目的是观察细胞表面膜受体EGFR及其引发的信号传导途径MAPK在小剂量照射模式下对细胞放射敏感性的影响及对辐射后细胞反应的调控作用,进一步阐述此照射模式下的放射生物学特点,并继续探讨在前期实验中发现的诱导老化的发生机制,以期人们重新关注细胞膜的作用,并为小剂量照射模式,如分次RIT的优化提供帮助。 小剂量电离辐射下EGFR的磷酸化和MAPK途径的激活 选用A549这一EGFR高表达的人肺腺癌细胞系,采用2Gy和6Gy两个相对较小的照射剂量,用免疫杂交(western blot)和激酶活性分析的检测方法,对比照射前后EGFR和ERK蛋白的磷酸化水平以及MAPK活性,并观察阻断剂AG1478和PD98059对照射后ERK蛋白的磷酸化水平和MAPK活性的影响。结果显示,EGFR磷酸化水平在照射后即刻即有显著提高,在照射后5min达到高峰。MAPK活性在照射后也有显著上升,并具有持续性。2Gy照射后EGFR的磷酸化水平和MAPK活性均低于相同时间点6Gy照射后水平,呈现剂量依赖性。AG1478和PD98059的应用使MAPK的基础和照射后活性均有明显下降。 MAPK途径对小剂量照射模式下细胞放射敏感性的影响 我们沿袭采用A549细胞和2Gy、6Gy两个照射剂量,用AG1478和PD98059阻断EGFR/MAPK途径,对比阻断前后细胞的克隆形成率、凋亡率和细胞增殖能力。我们对待检细胞进行annexin V/PI双标,用流式细胞仪检测凋亡率,并用MTT法绘制细胞生长曲线。结果显示,阻断EGFR/MAPK,使克隆形成率显著下降,AG1478和PD98059在2Gy和6Gy两剂量组中的辐射致敏因子分别为1.94和2.26、1.09和1.10。 军医进修学院博十论文 中文摘要 AG1478和 PD98059的应用,使6Gy剂量组的凋亡百分率从 l.sl分别提高至 3.14 和 3.of。两剂量下的生长曲线呈现不同的趋势:ZGy照射只能使 A549细胞的生长 变缓,6Gy照射则能完全阻滞细胞的增殖,并使细胞数很快下降。对于ZGy剂量 组,AG 1478和PD98059的加入,使照射后细胞的增殖速率进一步下降;对于 6Gy剂量组,两者的加入使照射后细胞数进一步下降,但两者对ZGy剂量组生长 曲线的影响更为明显。 EG*Rj M**K途径对辐射后*期阻滞和**A修复中的调控作用我们仍沿 袭采用 A549细胞,ZGy、6Gy的照射剂量,以及AG1478和 PD98059阻断 EGFR/MAPK途径。分别用 PI染色法、变星实验和 RT-PCR检测 GZ阻滞、DNA 损伤和 DNA修复基因 ERCC。XRC目的 mRNA,对比阻断前后三者的水平。结 果显示,阻断EGFR/MAPK途径,延缓了照射后GZ期比例的升高:使照射后 60min时间点 DNA残余损伤水平上升,但对初始损伤水平的影响不具有统计学意 义:照射使广**CI、***CI的*RN A水平均有明显上升,但阻断**Fw**PK 途径,使这一上升趋势明显受抑。 EGFR/MAPK/ P21与电离辐射后细胞内复制和诱导老化的关系 我们采用具 有不同 P53蛋白活性的 A549和 Hela细胞系,用 western blot检测 P53和 P21蛋白 水平,激酶活性分析检测MAPK活性,PI染色法检测细胞周期,SA一凡gal染色 法检测诱导老化。阻断**Fm**PK,对比阻断前后两细胞系n1 蛋白水平以及 Hela细胞多倍体核型及 SA-p{al染色阳性率。结果显示照射后 A549和 Hela的 PZI蛋白水平均有显著提高;阻断EGFR/MAPK途径,抑制了Hela细胞P21在照 射后的表达上调,但对A549细胞无明显的抑制作用。照射后Hela细胞的GZ期和 多倍体核型比例均高于A549细胞。阻断EGFR/MAPK途径,使Hela细胞内复制 及SA小名al染色阳性率均有所提高。 结论 l、细胞膜是电高辐射的重要作用部位,EGFR是主要靶分子之一。 2、电离辐射使EGFR发生了磷酸化,并激活了MAPK信号传导途径。 5 军医进修学院博士论文 中文摘要 3、电离辐射时短暂的电离事件引起MAPK活性持续升高;MAPK活性表现 出剂量依赖性。 4。电离辐射后EGFWMAPK途径对细胞有保护作用,阻断此途径有较显著 的放射致敏作用。 5、阻断EGFR/MAPK引起的生长曲线的变化,不能精确反映其对细胞增殖 潜力的影响。 6、电离辐射引起的GZ期阻滞有一定程度的EGFR/MAPK依赖性;阻断此途 径,使电高辐射所引起的GZ期阻滞延迟出现。 7、EGFR/MAPK途径可以在转录水平调控DNA修复基因 ERCCI和 XRCCI 的表达:阻断此途径,使**A修复过程受抑。 8、阻断EGFR/MAPK途径,细胞放射敏感性增加,细胞凋亡增多,与此途 径在GZ期阻滞和DNA修复中
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2002
【分类号】:R811.5

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