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《中国人民解放军军医进修学院》 2003年
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利用钙离子调节基因治疗慢性充血性心力衰竭的实验研究

鲁晓春  
【摘要】: 【背景】充血性心力衰竭的治疗是现代医学研究的重要课题。在心力衰竭的病理生理过程中,Ca~(2+)调节不仅仅决定着心肌收缩,影响心率变化,还在心力衰竭的演变过程中出现的长期的心脏肥厚、重塑等心脏结构改变发挥着重要作用。 在参与Ca~(2+)循环的各种Ca~(2+)调节蛋白中,PLN/SERCA2a比率直接反映着心功能的变化。通过转基因技术使SERCA2a过表达或采用反义技术和导入突变PLN基因等方法均可以明显增强心肌收缩力,改善心力衰竭动物的血流动力学状态。 RNA干涉(RNA interfrence,RNAi)是一种具有高度的序列专一性,特异地使特定基因沉默,使其功能丧失或降低的一种RNA诱导的基因转录后调控方式。其高度序列专一性和高效靶基因抑制效率的特点使以RNAi方法进行基因治疗的研究成为一新的热点。 我们的研究是利用病毒载体转基因使心肌细胞过表达SERCA2a,同时应用RNAi来降低PLN的表达,以期最大限度地调低PLN/SERCA比值,提高肌浆网对细胞内Ca~(2+)的摄取能力,从而促进心肌收缩。同时还构建了含β_2肾上腺素受体的γAAV载体。 【方法】将SERCA2a cDNA片段(-18~+3486)插入AdEasy系统穿梭载体pAdTrack-CMV质粒的CMV启动子下游,经细菌内重组和293细胞转染,最终获取重组腺病毒rAd-trSERCA2a。以Southern Blot分析鉴定外源基因在获取重组病毒中的整合,用PCR进行不同传代次数的重组腺病毒rrAd-trSERCA2a遗传稳定性分析。 以胶原酶及胰蛋白酶消化法获取乳鼠心肌细胞,进行体外培养。根据搏动细胞占总细胞的百分率和肌动蛋白免疫组织化学染色鉴定心肌细胞纯度。 以重组腺病毒rAd-trSERCA2a感染原代培养的心肌细胞,以RT-PCR 军医进修学院 博士学位论文 摘要 和 Western blot对 SERCAZa基因的表达进行半定量分析。 将 SERCAZa cDNA片段插入 rAAV通用载体质粒 pSNAV的 CMV启 动子下游,构建重组腺相关病毒rAAVSERCAZa。 用FITC标记的rAAV观察rAAV对心肌细胞感染的动态过程,以 rAAVGFP感染心肌后观察GFP表达,流式细胞仪检测GFP表达比。 rAAVSERCAZa感染BHK细胞行RTPCR分析SERCAZa表达。 半巢式 PCR扩增获得 U6 SnRNA和 HI RNP NA启动于,在 PLN mRNA序列(NM 022707)起始密码子下游寻找靶序列,Ril(59-78nt), AiZ(73一93nt),Al3(103-123nt),衔接头法构建质粒 pSNAVphRil,PCR 法构建pSNAVphRiZ、3,测序验证其序列正确性。包装生产出重组病毒 rAAVphm。将三种pSNAVphRi质粒转染心肌细胞,以rAAVpffe感染 心肌细胞,以 RTPCR和 Western blot对 PLN基因的表达进行半定量分析。 提取大鼠心肌总 RNA,RTPCR克隆得到针对 PLN CDNA编码区一108~ +552和十8~+552的PLNI和PLNs大小两片段,将二者5’端相连,插入 pAdTr肌kCMV 质粒的CMV 启动子下游,获得重组腺病毒 rAd1CPLN-l删Ai,PCR进行Pm片段的整合分析及遗传稳定性分析。 感染心肌细胞,RTPCR检测重组病毒对PLN基因表达的影响。 利用 Xcml酶切位点的特性对获得的 U6 snRNA和 HI RNP NA启动 于进行人工突变,构建制备出方向相对双 U6 snRNA和 HIRNP RNA启动 于 T/A载体 pUpTT和 pHpTT。PCR扩增出针对 luc基因编码区 86-187nt 位的片段,连入 pUpTT和 pHpTT获得 pUpTluCki、pHpTluCfo。将 pMAMneoLuc与 pUpTlucfo或 pHpTlucXi共转染 BHK2 细胞,转染后 24小时裂解细胞检测LllC强度。 用 pCR扩增获得人 hAVal基因,对 tRNAVal基因末端进行突变,得 到 tRNAVallinker片段,针对其编码区门~利 位碱基设计 shRNA片 段,经PCR方法连入tRNAWlinker构建出控制针对荧光素酶的s删A转 录载体pUC-lLNA“luchi,与 pMAMneoLuc共转染BHK2 细胞,观察对 IU。表达的影响。 【结果】重组腺病毒rAd-trSERCAZa,经Southern证实目的基因SERCAZa 整合于rAd-trSERCAZa基因组中,PCR检测显示多次传代重组病毒基因组 一Vll一 一 L) 军医进修学院 博*学位论文 摘要 稳定。感染心肌细胞后,约7~12h即可见GFP表达,48h镜下GFP表达 细胞数可达
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R541.6

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前2条
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【共引文献】
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中国重要会议论文全文数据库 前10条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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【二级参考文献】
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【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
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10 徐琳;高下;陈杰;朱光洁;麻晓峰;丁小琼;陆玲;;Ad-Hath1-DsRed2,Ad-DsRed2重组腺病毒的构建及小鼠耳蜗圆窗径路基因导入的实验研究[A];2010全国耳鼻咽喉头颈外科中青年学术会议论文汇编[C];2010年
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