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《中国人民解放军军医进修学院》 2003年
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体外血管钙化与细胞增殖的关系及其氟伐他汀对钙化影响的实验研究

刘立新  
【摘要】: 目的:本研究通过β-甘油磷酸盐处理牛主动脉平滑肌细胞,建立细胞水平的体外血管钙化模型,借此观察多种非胶原类骨基质蛋白钙化期间的表达、分泌情况,以及细胞增殖、细胞凋亡/死亡情况,初步探讨其可能的机制。此外,加用氟伐他汀进行干预,观察其对体外血管钙化的影响并探讨可能的作用机制。 方法:(1)第一部分:组织块法原代培养牛主动脉中膜平滑肌细胞。选用8代以内的传代细胞,添加终浓度为10mmol/L β-甘油磷酸盐培养10天诱导钙化;利用Von Kossa染色、茜素红-S染色及检测细胞层钙沉积对钙化进行鉴定,同时观察细胞层碱性磷酸酶活性和培养上清骨钙素含量。(2)第二部分:采用噻唑兰(MTT)比色试验、台盼兰排斥试验观察不同浓度β-甘油磷酸盐对牛主动脉平滑肌细胞增殖的影响,利用流式细胞分析术观察钙化期间细胞凋亡、细胞周期的情况。(3)第三部分:体外血管钙化期间,添加终浓度为10~(-6)、10~(-7)、10~(-8)mol/L氟伐他汀进行干预,检测细胞层钙沉积、碱性磷酸酶活性和培养上清骨钙素含量,观察氟伐他汀对钙化的影响;利用RT-PCR、Western blot方法检测正常培养细胞、钙化组及氟伐他汀治疗组的骨桥蛋白、骨连接素基因、蛋白水平的表达情况。 结果:(1)β-甘油磷酸盐处理10天后,光镜及电镜显示培养细胞出现广泛分布的钙盐沉积,Von Kossa、茜素红-S钙染色均呈阳性,细胞层钙沉积升至正常对照的28.44倍,较实验初增加了293倍(P<0.01),从而证实体外血管钙化模型建立成功。(2)β-甘油磷酸盐能够时间依赖性增加细胞层钙沉积,细胞层碱性磷酸酶活性、培养上清骨钙素含量也随时间的延长而增高,各时间点均高于正常对照(P<0.01);此外,RT-PCR、Western blot证实钙化组的骨桥蛋白mRNA及蛋白表达明显增高,而骨连接素mRNA及蛋 旱巨域修斗腕协士学位公义 幻县 白表达略有下降。o)p-甘油磷酸盐能以时间、浓度依赖性抑制牛主动脉 平滑肌细胞增殖,并且钙化组的MTT光密度值、活细胞计数与正常对照相 比,实验第 4天起己有明显差异(HO.01);④ 钙化组的细胞凋亡率随时 间的延长而呈增多趋势,并与细胞层钙沉积有相关性(r=0.9,HO.05)。 (5)细胞周期分析显示,钙化组G;期细胞略有增加,S期细胞减少,G。M 期细胞改变不明显,细胞增殖指数k 下降。(6)氟伐他汀能够剂量依赖 性减少细胞层钙沉积,以 10-‘mo l/[。浓度组最为明显,使细胞层钙沉积减少 了 27%(HO.05入 门) 应用氟伐他汀后,细胞层碱性磷酸酶活性改变不明 显,但培养上清骨钙素含量显著下降(HO.05);RT-PCR、Western blot分 别从基因、蛋白水平证实骨桥蛋白表达下降、骨连接素表达增加。 结论:*)卜甘油磷酸盐能在短时间内诱导出牛主动脉平滑肌广泛钙 化,是一种良好的体外血管钙化模型。(2)体外血管钙化期间,多种非胶原 类骨基质蛋白的表达、分泌发生改变,提示血管钙化类似骨矿化,是一个 主动、可调控的过程。(3)体外血管钙化期间,平滑肌细胞增殖明显受抑 制,死亡细胞增多,并有少量细胞凋亡,凋亡率与钙化程度相关,提示凋 亡可能参与了钙化过程。山 体外血管钙化能够影响细胞周期,使G1期细 胞增多,预示成熟、有合成能力的细胞相对增多八5)首次证实氟伐他汀 能够减轻体外血管钙化程度,提示氟伐他汀可用于体内血管钙化的治疗。 (6)氟伐他汀能够影响非胶原类骨基质蛋白如骨连接素,骨桥蛋白、骨钙 素的表达或分泌,可能通过转变细胞表型、影响细胞功能而干预钙化。(7) 首次证实卜甘油磷酸盐能够下调骨连接素的表达,提示其诱导钙化的能力 可能与之有关。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2003
【分类号】:R54

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