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细胞光敏损伤位点的实验研究

戴维德  
【摘要】:研究目的 对三套荧光显微成像系统在国产新型光敏剂HMME亚细胞定位研究中的应用特点进行比较,建立新型的亚细胞分布定量分析方法和光敏损伤位点的实时光学检测方法,探讨光敏剂亚细胞分布的影响因素。 方法和结果 分别应用LSCM、CCD荧光显微成像系统、ICCD荧光显微成像系统及荧光探针标记技术,采用新建立的细胞器—细胞荧光强度比值法,对HMME进行单细胞内分布的定性与定量研究,考察不同孵育时间、细胞种类以及血浆蛋白结合状态等因素对光敏剂细胞内分布的影响。对单细胞内活性氧探针DCF荧光图像进行探测与分析,并结合细胞器探针的应用,研究HMME-PDT效应所致单细胞内ROS产生位置的亚细胞定位。观察照光前后与过程中单细胞内细胞器探针荧光的形态学变化,研究HMME-PDT损伤位点的亚细胞定位与损伤的动态过程。 结果显示:(1)LSCM和CCD成像系统能采集到浓度达到160μg/ml时的HMME的荧光图像,而ICCD成像系统只需HMME浓度为5μg/ml,荧光图像特点都呈胞浆中荧光强度较高且分布不均,细胞核区荧光较弱的中空现象。前两套系统获得荧光探针图像信息显示所标记的细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体区域平均荧光强度比值(J_1/J_2值)都明显高于细胞内J_1/J_2值。ICCD系统对细胞器探针荧光图像在空间分辨上不理想。(2)随着孵育时间延长,A549肺癌细胞内四种细胞器区域J_1/J_2值都升高且溶酶体升高幅度最大,而鼠肺内皮细胞内只有溶酶体区域呈升高趋势,其余三种细胞器区域J_1/J_2值均呈下降趋势;A549细胞溶酶体J_1/J_2值升高的幅度明显高于鼠肺内皮细咆。(3)孵育2h与12h比较,不含血清组中四种细胞器内HMME的J_1/J_2值都有升高,以线粒体、内质网和高尔基体较显著,溶酶体稍有升高;A1b组中四种细胞器中溶酶体的J_1/J_2值升高较显著,其余三种细胞器则略有升高;LDL组中四种细胞器中溶酶体的J_1/J_2值升高更加显 军医进修学院博士学位论文中文摘要 著,其余细胞器的JI/Jz值升高幅度明显大于Alb组。(4)细胞总荧光光强在光照 后较光照前降低26.4%;光照后线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体分别降低了 31 .1%、23.4%、5.8%和5%。线粒体区域在单纯光照和有HMME存在情况下后均 检测到DCF荧光的增强。(5)线粒体探针Rh‘)damine一123的荧光图像形态特征在 PDT损伤前后差异显著;灿odamine一123在PDT损伤后再分布于细胞核区。 结论(1) LSCM与CCD成像系统限于其探测灵敏度,对于弱荧光性光敏剂, 适用于其高孵育浓度条件下的亚细胞定位研究。二者获得的实验结果相一致:孵 育24h,HMME在鼠肺内皮细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体均有分布 而几乎不进人细胞核。本课题建立的ICCD成像系统可不受孵育浓度条件的限制, 实现光敏剂极微弱荧光的有效探测,但空间分辨率较低。(2)细胞种类和孵育时 间是光敏剂亚细胞分布的重要影响因素。随着孵育时间的延长,A549肺癌细胞各 细胞器吸收光敏剂能力逐渐增强,尤以溶酶体显著;而鼠肺内皮细胞中除溶酶体 外其余三种细胞器吸收光敏剂能力逐渐减弱。(3)在短时间内HMME主要以游离 状态单纯扩散形式进人细胞,以高尔基体、线粒体等细胞器为主要分布位点。随 着孵育时间的延长,HMME可以和血浆蛋白结合,以胞吞形式进入细胞,和LDL 结合的HMME更易穿过细胞膜,溶酶体吸收HMME能力增强。(4)光照后线粒 体区域HMME光漂白速率较快;线粒体区域产生数量较多的单线态氧。(5)HMME 介导的PDT效应导致亚细胞水平多位点损伤,线粒体和核膜可能是PDT敏感位 点:荧光探针标记检测PDT损伤亚细胞位点方法简便可靠。


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