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《中国人民解放军军医进修学院》 2004年
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血卟啉单甲醚光动力治疗诱导Hela细胞死亡机制的初步研究

丁新民  
【摘要】:目的 血卟啉单甲醚(Hematoporphyrin monomethyl ether,HMME)是我国自行研制的单体卟啉类光敏剂。目前对以HMME为光敏剂的光动力治疗(HMME-PDT)诱导靶细胞死亡的机制还不了解。本研究以HeLa细胞为靶细胞,从HMME-PDT诱导HeLa细胞死亡及HeLa细胞抵御死亡两个方面,对HMME-PDT诱导靶细胞死亡的机制进行初步的研究。 方法和结果 (1)不同活性氧成分在HMME-PDT诱导靶细胞死亡中的作用:用Hochst33342等染色荧光显微镜观察PDT后细胞形态学变化,用MTT法及AnnexinV和PI双染流式细胞仪检测法分别检测细胞的存活率及凋亡率和坏死率。荧光显微镜观察结果显示:在HMME-PDT后24h,HeLa细胞可出现细胞核固缩或碎裂,有凋亡小体形成。MTT结果显示:单线态氧特异性的淬灭剂叠氮钠(SA)或羟自由基特异性的淬灭剂D-甘露醇(DM)均可抑制HMME-PDT导致的细胞死亡(以往研究表明单线态氧和羟自由基分别是Ⅱ型和Ⅰ型光动力反应的产物)。在PDT后6h的AnnexinV-PI双染流式细胞仪检测结果显示:SA以减少细胞坏死为主,而DM以减少细胞凋亡为主。(2)线粒体、内质网在HMME-PDT诱导靶细胞凋亡中的作用:用Fura-2/AM负载荧光分光光度计检测细胞质的游离钙浓度([Ca~(2+)]i),细胞总蛋白中SERCA_2和细胞质中(去线粒体)细胞色素C(CytoC)的含量变化用Western杂交法检测,用特异性底物剪切荧光分光光度计法检测半胱天冬酶-3(CAP-3)活性,细胞的存活率及凋亡率和坏死率分别用MTT法及AnnexinV和PI双染流式细胞仪检测法检测。结果显示:在PDT后即刻就有[Ca~(2+)]i的增高,且照光剂量越大[Ca~(2+)]i增高越明显,SA或DM均可抑制 军医进修学院博士学位论文 HM加[E一DT诱导HeLa细胞死亡机制的初步研究 [Caz+]i的增高;在PDT后60min内,照光剂量越大,sERc弋蛋白含量下降 也越明显;SA或DM也均可抑制SERCAZ蛋白含量的下降.在PDT后,存 在细胞质CytoC含量和C妙一3活性增加,用SA、DM或膜通透性钙离子鳌 合物B妙毛叼AM均可抑制它们的增加。用BAP毛叼AM拮抗[C扩勺i的升高, PDT后HeLa细胞的存活率增加、凋亡率和坏死率均下降。(3)靶细胞抵御 HMME一PDT诱导死亡的机制:在PDT后0.5、2、6和12h,HeLa细胞中总 的或磷酸化的ERKI/2或p38MA卫K含量用Western杂交法检刚,用MTT法和 内mexinV一PI双染流式细胞仪检浏法检测细胞的存活率及凋亡率和坏死 率。结果显示:在PDT后各时间点,磷酸化ERKI/2的含量均比对照组高, 最高可达对照组的10倍左右(在PDT后Zh);而磷酸化P3 SMApK的含量只在 PDT后2和6h增加,但最高可达对照组的110倍左右(也在 PDT后2h)。用 ERKI/2特异性的抑制剂PD98059或p38MApK特异性的抑制齐dSB203580, 可使PDT后细胞的存活率下降、凋亡率和坏死率均增加。 结论HMME一PDT在HeLa细胞内可同时发生I型和n型光动力反应,n 型光动力反应产物单线态氧导致细胞坏死为主,I型光动力反应产物乡自 由基以导致细胞凋亡为主。HMME一PDT可使HeLa细胞的内质网膜上 sERCAZ降解和线粒体内CytoC转位于细胞质。HM侧田一PDT也可使[Ca2+1i 升高,〔caZ+]i的升高促进HeLa细胞发生凋亡和坏死,从而增加HeLa细胞 的死亡。HeLa细胞也可通过活化ERKI/2和p38MApK,来抵御HMME一PDT 诱导的死亡。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2004
【分类号】:R73-3

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【参考文献】
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