花生四稀酸对胰岛β细胞功能的作用及其机理研究

【摘要】：花生四稀酸对胰岛β细胞功能的作用及其机理研究 糖尿病业已成为全球范围内日益严重的公共健康问题，目前全球糖尿病患者约1.7亿人。我国现有糖尿病患者约4000万人，其中90％以上的患者为2型糖尿病(T2DM)；而且2型糖尿病、肥胖和高脂血症的发生率呈现逐年递增并向年青化发展的趋势。在这些疾病中，胰岛素抵抗是其主要原因，脂代谢异常是它们的共同特点。T2DM中超过80％的人表现为超重或肥胖，而超重肥胖同时又是发生2型糖尿病很强的危险因素。肥胖和T2DM几乎均有不同程度的脂代谢异常，即血浆游离脂肪酸(frec fatty acids, FFA)，胆固醇(Chol)，小而致密的低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯(TG)水平增高，而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低。 在典型的2型糖尿病患者中，胰岛β细胞功能的损害不是由高血糖、蛋白的糖化和淀粉样物质的沉积，而是由于脂毒性作用(血清游离脂肪酸浓度增高或／和甘油三酯在胰岛β细胞中的沉积)所致。人体尸检资料显示，胰岛β细胞的脂肪含量出现年龄相关性变化，而胰岛α细胞或导管细胞不出现年龄相关性的改变。令人感兴趣的是，在胰岛素抵抗的患者中，只有三分之一的人发展成为2型糖尿病，而其余的三分之二通过增加胰岛素分泌或释放来代偿胰岛素抵抗。发生这种病理生理的机理是：游离脂肪酸，特别是饱和脂肪酸可减少胰岛β细胞合成和分泌胰岛素；甘油三酯在胰岛β细胞中的沉积增加，导致胰岛β细胞的凋亡增多，引起β细胞分泌胰岛素的功能下降。 T2DM患者常存在肥胖和／或血浆游离脂肪酸增高。体内外实验已经证明，血浆FFA增加，在空腹状态下有刺激胰岛β细胞分泌胰岛素的作用；但长期升高可抑制胰岛素的分泌，造成胰岛素分泌量的减少，并且抑制胰岛素对靶组织，如肝脏和肌肉的生物学效应。例如0.5 mmol／L的FFA有促进胰岛素分泌的作用，而FFA进一步升高却抑制胰岛β细胞分泌胰岛素的功能，称之为β细胞脂毒性作用(Lipotoxicity)。血浆中FFA增高，细胞内长链脂肪酰CoA(LC-CoA)浓度增加。 军医进修学院 解放军总医院 出站报告 中文摘要 作为一个信号分子，LC一CoA可以调节细胞葡萄糖激酶、葡萄糖一6一磷酸酶，胞 吐，高尔基体的融合，内质网钙离子，PKC(蛋白激酶C)，CPT-1(肉碱棕搁酞 转移酶一l)、AcC酶(乙酞辅酶A梭化酶)和基因表达等。胰岛p细胞内Lc一CoA 浓度增加后可作用于上述胰岛素合成和分泌的各个环节，从而影响胰岛p细胞分 泌胰岛素的功能。此外，各种FFA对p细胞分泌胰岛素的功能的作用不完全相 同，随碳链的增长和饱和程度增加，它对胰岛p细胞分泌胰岛素的刺激作用增加。 我们既往的研究已经证明，生理浓度1一20倍的AA能剂量依赖性的抑制饱 和脂肪酸对颗粒细胞和翠丸Leydig细胞的致凋亡作用，AA浓度高于50倍生理 浓度后其本身对细胞也有毒性作用，甚至引起细胞凋亡。这一结果说明血浆中饱 和脂肪酸和AA的浓度比例对于细胞的功能非常重要。AA在不同浓度情况下对 胰岛日细胞可能有不同的作用。因此，我们推测AA可能具有拮抗饱和脂肪酸引 起的胰岛素分泌和合成功能的障碍以及细胞毒性作用。为此，我们选择胰岛p细 胞作为研究对象，研究AA对饱和脂肪酸引起的p细胞合成和分泌胰岛素功能的 损伤有无保护作用，以及AA是否能拮抗饱和脂肪酸诱导的p细胞凋亡作用。 材料与方法胰岛p细胞株N工T-1在含10%胎牛血清的D入IEM培养基中培 养，当NIT-1细胞融合70一80%后，经0.25%胰蛋白酶消化，将细胞接种于24 孔培养板内，细胞继续培养24一72h后，分别用饱和脂肪酸，包括软脂酸(PA)和 硬脂酸(sA)，单不饱和脂肪酸oA，多不饱和脂肪酸亚麻酸(L nA)和花生四稀酸 (AA)以及各种阻断剂，包括环氧合酶、脂氧合酶、蛋白激酶等处理24一%h，然 后使用MTT测定活细胞数;或收集细胞培养上清测定胰岛素;或用TRIzol试剂 提取细胞RNA检测细胞Glucokinase和PDx-l基因的表达伽orthem blot);或使 用流式细胞仪检测细胞凋亡。 结果 1趴、SA、OA和LnA能够时间和剂量依赖性地抑制胰岛仔细胞的存活率， 600协mol/L的PA、sA、oA和L叭于培养4天后，其抑制率分别为52%、51%、 “%和35%。5拼M的AA即具有刺激细胞生长的作用(外0.05)，而10林M的AA 于培养48h后具有明显的刺激细胞生长(P0 .05);但是，巧协M的AA于培养 96h后具有明显的抑制细胞生长的作用，其抑制率为15%，P0.05;而30协M的 人A于培养24h后即具有明显的抑制细胞生长的作用，尸 0.05。 军医进修学院 解放军总医院 出站报告 中文摘要 2.PA与p细胞孵育的同时加入AA(10卿ol/L)，则AA能显著地降低PA对p 细胞的抑制作用，尸0.01;蛋白激酶C阻断剂GFlo92o3X(lo、mol/L)、c扩十阻 断剂Nifedipine(10脚ol几)和钙调蛋白阻断剂W一7(20林mol/L)能显著地阻断AA (10林mol/L)的这种保护作用，p0.01;脂氧合酶阻断剂NDGA(10协mol几)、环 氧合酶阻断剂玩domethaein(10仁mol/L)、P45O代谢通路阻断剂Ketoconazole(10 林mol几)、p45o代谢产物20一HETE和LB;(80 nmol几)、蛋白激酶A抑制剂H一89(20 卿01/L)、酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein(50娜01/L)、No供体sN好(10 协mol/L)以及NF一Kb抑?

【关键词】：2型糖尿病 花生四稀酸 胰岛β细胞 软脂酸 硬脂酸 胰岛素 细胞凋亡 Glucokinase PDX-1
【学位授予单位】：中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2004
【分类号】：R587.1
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