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《中国人民解放军军医进修学院》 2005年
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P210~(bcr/abl)激活鞘氨醇激酶信号通路的初步研究

黄文荣  
【摘要】:慢性粒细胞白血病(chronic myelogcnous leukemia,CML)是一种以髓系细胞受累为主的多能造血干细胞的克隆性疾病。目前认为CML的主要分子发病基础为:位于9q34的abl基因与位于22q11的bcr基因相互易位形成bcr/abl融合基因,并编码具有很强蛋白酪氨酸激酶活性的P210~(bcr/abl)融合蛋白,该蛋白通过多种信号通路抑制细胞凋亡而导致细胞转化。细胞膜鞘磷脂代谢的两种重要产物,即神经酰胺和1-磷酸鞘氨醇(S1P)的动态水平也是决定细胞凋亡和增殖的重要因素。神经酰胺促进细胞凋亡,抑制细胞增殖;而1-磷酸鞘氨醇则抑制细胞凋亡、刺激细胞生长增殖。鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase,SphK-1)作为S1P生物合成调节的关键限速酶,与细胞抗凋亡、增殖效应密切相关。本研究重点探讨了P210~(Bcr/Abl)的抗凋亡效应是否与SphK-1/S1P信号通路有关,以便为CML的发病和治疗提供新的作用靶点。 首先我们利用RT-PCR证实了bcr/abl阳性的CML细胞表达SphK-1信号通路的相关分子。K562细胞和bcr/abl阳性的原代CML细胞均表达SphK-1和S1P受体mRNA。格列卫可以竞争性地结合到P210~(bcr/abl)的三磷酸腺苷酸结合位点而特异性地抑制其酪氨酸激酶活性,为探讨CML细胞中P210~(bcr/abl)和SphK-1信号通路的关系,我们利用格列卫处理bcr/abl阳性的K562细胞和CML原代细胞,然后通过~(32)P-ATP掺入法测定细胞内SphK-1的酶活性。K562细胞在使用格列卫处理后SphK-1活性较对照下降(36.7~55.8)%,CML原代细胞在使用格列卫处理后SphK-1活性较对照下降(16.8~41.9)%,间接提示P210~(bcr/abl)可能具有激活SphK-1的作用。 为进一步证实P210~(bcr/abl)对SphK-1的激活作用,我们构建了携带b3a2型bcr/abl融合基因的逆转录病毒载体。将重组质粒转染包装细胞制备重组逆转录病毒感染Mo7e细胞,然后裂解、收集转染bcr/abl融合基因的Mo7e-P210细胞和转染空载体的Mo7e-pLXSN细胞的胞浆蛋白测定SphK-1酶活性,Mo7e-P210细胞的SphK-1活性比Mo7e-pLXSN细胞高(23~32)%,直接提示P210~(bcr/abl)能激活SphK-1。为进一步确定P210~(bcr/abl)对细胞SphK-1的激活作用,我们进一步使用Tet-off诱导表达系统观察了P210~(bcr/abl)对SphK-1活性的影响。将bcr/abl融合基因亚克隆到
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R733.72

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