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《中国人民解放军军医进修学院》 2005年
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抑制纤维连接蛋白的合成诱导大鼠系膜细胞凋亡的机制研究

吴镝  
【摘要】:目的:肾小球硬化和/或间质纤维化是肾脏疾病走向终末期肾功能衰竭的最终途径。肾脏纤维化过程中普遍存在着细胞外基质(ECM)的过度积聚和细胞增殖。纤维连接蛋白(fibronectin,FN)是ECM重要成分之一,在细胞粘附、移动、增殖等方面起着极其重要的作用。在大多数肾小球硬化及间质纤维化中都可观察到FN的过度积聚。本研究目的在于,利用RNAi(RNAinterference)技术,直接抑制内源性FN的合成。观察FN的缺失对大鼠肾脏系膜细胞增殖与凋亡的影响。进而阐明凋亡的途径以及细胞内钙离子的异常在凋亡中的作用。 方法:分离并培养大鼠原代肾小球系膜细胞。体外合成siRNA(small interference RNA),选取抑制效果最佳的片段。构建表达ShRNA(small hairpin RNA)的逆转录病毒载体,稳定抑制大鼠系膜细胞FN的表达。应用实时定量PCR、Western blot、细胞免疫荧光检测FN的表达水平。应用JC-1染色检测线粒体功能。流式细胞仪技术检测凋亡细胞数量。在细胞培养过程中加入环孢霉素A、外源性FN以及caspase3、8的阻断剂,判定细胞凋亡的途径。利用共聚集显微镜检测应激条件下内质网InsP_3(1,4,5-tdphosphate receptor)受体及RyR(Ryanodine receptor)钙通道的开放情况。在诱导凋亡过程中加入L型钙通道阻断剂及内质网钙InsP_3受体及RyR钙通道阻断剂,确定钙离子在FN缺失导致凋亡中的作用。 结果:合成的siRNA及逆转录病毒载体所表达的shRNA都可以有效地抑制系膜细胞FN的合成,而且长时间的抑制会导致系膜细胞出现凋亡。FN缺失后出现的细胞凋亡过程中,发现内源性凋亡途径的主要成分细胞色素c释放、caspase 9和caspase 3的激活;而外源性凋亡途径的最主要成分caspase8的表达没有明显变化,并且caspase 8被特异阻断后,不影响FN缺失诱发的细胞凋亡。该结果提示内源性凋亡途径的启动是FN缺失后细胞凋亡的原因,而外源性凋亡途径在此凋亡中不起主要作用。进一步对凋亡启动机制的
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2005
【分类号】:R692

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