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TIMP-1过表达对糖尿病胰腺β细胞损伤保护作用的机制研究

朱晗玉  
【摘要】:背景与目的:金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase-1,TIMP-1)是基质金属蛋白酶抑制剂家族的主要成员,是一种多功能蛋白,参与多种病理和生理过程。TIMP-1除抑制基质金属蛋白酶(mattix metalloproteinase,MMP)的活性外,尚具有促进细胞增殖/抑制细胞凋亡、促进类固醇激素合成、抗血管生成等功能。最近研究表明,TIMP-1在体外能抑制IL-1β,TNF-α,IFN-γ等细胞因子介导的胰腺β细胞凋亡,而β细胞凋亡在糖尿病的发病机制中起着至关重要的作用。据此,我们假设,TIMP-1可能通过抑制胰腺β细胞凋亡而延迟链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的糖尿病发生。但目前尚无在动物整体水平研究TIMP-1对胰腺β细胞损伤保护作用的报道。故本研究拟建立人TIMP-1(human TIMP-1,hTIMP-1)转基因纯系小鼠,并利用该动物模型,探讨TIMP-1对STZ诱导的胰腺β细胞损伤可能存在的保护作用及其机制。 方法:(1)利用本室前期采用受精卵原核显微注射技术获得的hTIMP-1转基因首建鼠进行传代,采用传代鉴定和荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术相结合的方法筛选纯合子,建立hTIMP-1转基因纯系小鼠;利用Southern blot及反向PCR相结合的方法,鉴定外源基因在转基因小鼠基因组中的整合形式;利用Northern blot的方法研究外源基因hTIMP-1在转基因小鼠的组织表达谱。(2)利用获得的hTIMP-1转基因纯系小鼠,观察不同剂量STZ对其血糖及存活率的影响;TUNEL染色观察STZ(100mg/kg)刺激后胰岛细胞凋亡的时相变化,确定凋亡高峰;运用TUNEL和胰岛素双重染色观察凋亡高峰时,转基因模型组和正常模型组小鼠胰岛β细胞凋亡的情况:运用RT-PCR及Western blot检测凋亡高峰时,凋亡相关因子Bcl-2、Bcl-X_L、Bax的表达,以及caspase-3、caspase-9的表达。


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