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《中国人民解放军军医进修学院》 2007年
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主动外排系统介导的鲍曼不动杆菌多重耐药机制研究

董涛  
【摘要】: 【研究背景】鲍曼不动杆菌已成为引起严重致死性院内感染重要病原菌,常表现为对多种抗菌药物耐药即多重耐药,易引起医院获得性肺炎、菌血症、泌尿系统感染、脑膜炎、软组织感染以及腹腔内感染等严重感染。特别是近年国内外报道耐碳青霉烯类多重耐药鲍曼不动杆菌,在重症监护病房、血液病房引起爆发流行,病死率高。鲍曼不动杆菌感染治疗越来越困难,临床治疗面临着严峻的挑战。因此加强对其耐药性监测,研究其耐药分子机制,对于控制和治疗鲍曼不动杆菌引起的医院内感染具有重要的现实意义。 【目的】筛选分离鲍曼不动杆菌临床菌中多重耐药菌株,测定其耐药表型及耐药模式;以氟喹诺酮类和氨基糖苷类为代表测定外排泵抑制剂对抗菌药物对鲍曼不动杆菌抗菌活性的影响;研究临床分离鲍曼不动杆菌中外排泵基因表达情况;测定鲍曼不动杆菌外膜蛋白,分析其与鲍曼不动杆菌多重耐药性的关系。 【方法】(1)采用琼脂二倍稀释法检测24种抗菌药物对87株鲍曼不动杆菌的耐药表型;用RAPD分型方法分析多重耐药鲍曼不动杆菌的基因同源性。(2)琼脂二倍稀释法测定外排泵抑制剂(利血平和CCCP)对氟喹诺酮类和氨基糖苷类抗茵药物对鲍曼不动杆菌的抗菌活性的影响:初步探讨鲍曼不动杆菌临床分离株中外排泵的分布情况。(3)设计外排蛋白(AdeABC)基因特异性引,PCR扩增多重耐药鲍曼不动杆菌各克隆中外排蛋白基因,通过DNA测序及在GeneBank上进行序列比对分析测序结果,了解外排泵蛋白基因结构;分析外排蛋白表达阳性菌株在耐药表型方面的差异。(4)提取多重耐药鲍曼不动杆菌外膜蛋白,进行SDS-PAGE分析,研究其与多重耐药性的关系。 【结果】(1)87株不动杆菌经常规生化反应和Vitek系统进一步鉴定,确定为鲍曼不动杆菌。24种抗菌药物敏感性试验结果显示,有68株细菌为多重耐药菌株,除亚胺培南、左氧沙星和加替沙星耐药率低于35%外,其余 抗菌药物耐药率均65%以上。(2)RAPD结果显示,68株多重耐药鲍曼不动杆菌菌株中分6个克隆株,其中A型5株、B型8株,C型5株,D型47株,E型2株,F型1株。(3)利血平存在下68株多重耐药鲍曼不动杆菌对环丙沙星、左氧氟沙星和加替沙星的敏感性分别由20.7%、44.8%、44.8%提高到26.4%、69.2%、66.7%;耐药率则分别由75.9%、32.2%、24.1%降低到71.3%、18.4%、10.3%。经stata统计软件方差分析,利血平存在与否左氧氟沙星和加替沙星对鲍曼不动杆菌敏感性有显著性差异统计学意义,但利血平对环丙沙星对鲍曼不动杆菌的敏感性影响差异无统计学意义;对妥布霉素、庆大霉素和丁胺卡那霉素的敏感率分别由27.6%、20.7%、30.0%提高为29.9%、25.3%和33.3%,经stata统计软件方差分析,利血平存在与否三种氨基糖苷类药物对鲍曼不动杆菌的敏感性均无统计学差异。CCCP存在下环雨沙星、左氧氟沙星、加替沙星三种药物对鲍曼不动杆菌的敏感率分别由20.7%、44.8%、44.8%提高到27.3%、73.3%和67.5%;耐药率则分别由75.9%、32.2%、24.1%降低到69.3%、17.1%和6.9%,经stata统计软件方差分析,CCCP存在与否左氧氟沙星和加替沙星对鲍曼不动杆菌敏感性有显著差异有统计学意义,但CCCP对环丙沙星对鲍曼不动杆菌的敏感性影响无统计学差异(P值为0.2981);对妥布霉素、庆大霉素和丁胺卡那霉素的敏感率分别由27.6%、20.7%、30.0%提高为29.9%、26.4%和33.3%,经stata统计软件方差分析,CCCP存在与否三种氧基糖苷类药物对鲍曼不动杆菌的敏感性差异均无统计学意义。CCCP存在时筛选出的外排泵阳性菌株环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星分别为13株、16株、17株;妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素分别为8株、9株、8株。利血平存在时筛选出的外排泵阳性菌株环丙沙星、左氧氟沙星、加替沙星分别为10株、14株、11株;妥布霉素、庆大霉素、丁胺卡那霉素分别为6株、8株、8株。外排泵阴性菌株共217株,占39.7%。(4)6个克隆株中随机选取的多重耐药菌株外排蛋白基因测定结果显示,除B型克隆株外其余各克隆株外排蛋白基因均为PCR扩增阳性,在GeneBank上经Blast比对结果99%与AF370885.1同源。(5)对68株多重耐药鲍曼不动杆菌外膜蛋白进行SDS-PAGE检测发现,其中32株菌在约28KDa外膜蛋白条带明显减弱或缺失,其中17株菌受外排泵抑制剂影响可提高其对氟喹诺酮类或/和氨基糖苷类抗菌药物的敏感性;除b12号和b17号菌株属第4种耐药模式外,其余菌株均属第一种耐药模式,多重耐药情况严重。 【结论】(1)北京地区医院中多重耐药鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类敏感性明显下降,对其他药物尤其是第三、四代头孢菌素类及β-内酰胺酶抑制剂复合制剂敏感性也显著降低,同时对磺胺类、氨基糖苷类耐药率较高。(2)本研究发现外排泵抑制剂利血平和CCCP均可增强氟喹诺酮类药物的抗菌活性,尤以左氧氟沙星和加替沙星表现明显,而对氨基糖苷类药物的影响并不很明显。提示本研究所收集的多重耐药鲍曼不动杆菌对氟喹诺酮类的耐药与主动外排密切相关。(3)RAPD结果显示,68株多重耐药鲍曼不动杆菌菌株中分6个克隆株,提示多重耐药鲍曼不动杆菌菌株来源有很大差异,是由多个独立来源发展而来的,可能与抗菌药物选择压力相关。(4)外排蛋白基因在多重耐药鲍曼不动杆菌中表达阳性,其结构与Genebank同源性达99%。(5)多重耐药鲍曼不动杆菌中外膜蛋白缺失明显。(6)北京地区分离鲍曼不动杆菌多重耐药机制为:主动外排蛋白表达增强和外膜蛋白缺失同时存在。(8)在今后的研究中有待深入了解外排蛋白基因的调控机制及与外膜蛋白作用的关系,以明确外排系统在多重耐药机制中的作用,为更进一步研究防止耐药性在种间传播提供科学依据。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R516

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