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《中国人民解放军军医进修学院》 2007年
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正常血钾型周期性麻痹SCN4A基因新突变R675Q的功能研究

吴磊  
【摘要】: 目的:体外构建R675Q突变的人骨骼肌钠离子通道(pRcCMV-R675Q-SCN4A)真核表达载体,磷酸钙沉淀法转染HEK-293细胞,研究突变钠电流的电生理特点,进一步解释周期性麻痹的发病机制,为从分子水平诊断和更有效的治疗本病打下基础。 方法:设计带突变位点的引物,以含有人骨骼肌钠离子通道cDNA的质粒为模板体外定点诱变,构建R675Q突变型人骨骼肌钠离子通道真核表达载体。质粒大提取试剂盒抽提、纯化质粒后脂质体瞬时转染到HEK—293细胞中,转染24h和48h后,用RT-PCR和Western—blot方法验证目的基因的和蛋白的表达水平;磷酸钙沉淀法瞬时转染质粒后24h全细胞记录钠通道的门控特点。 结果: 1.测序证实pRcCMV-R675Q-SCN4A在相应位点有突变。 2.转染后24h和48h,通过RT-PCR可以检测到目的基因的表达,其中未转染细胞的相对光密度为0.34±0.044,转染24h后为0.72±0.05,转染48h后为0.79±0.04;转染后目的基因表达量显著增加(p<0.01)。转染后24h和48h通过Western—bolt可以检测到目的蛋白的表达,未转染细胞相对光密度为0.09±0.01,,转染后24h为0.57±0.06,转染后48h为1.15±0.04;转染后目的蛋白表达量显著增加(p<0.01)。 3.野生型(widetype WT)钠电流平均峰值(1798.9±106.5pA;n=35)高于R675Q突变型钠电流平均峰值(1035.6±57.3pA;n=22),统计学处理有显著差异(p<0.01)。R675Q突变型钠电流的快速失活和失活后恢复的特点和WT型相似,快速失活及恢复时间常数ζ的统计学处理无显著差异。R675Q钠通道的快速激活的电压电导(G-V)曲线V_(1/2)相对WT钠通道向去极化方向移动约7mv,统计学处理有显著差异(p<0.01)。 4.40s预刺激(conditioning pulse CP)后细胞慢失活电流达到稳态,可以得到慢失活的电压依赖性特点。R675Q慢失活明显提高,其电压依赖性曲线较WT向超极化方向移动约29mv。 5.通过改变CP的时间得到钠通道进入慢失活状态的比率。在CP为—75mv和—10mv时,R675Q和WT钠通道进入慢失活的比率大致相同,R675Q钠通道在长时间的预刺激后相对电流INa更小,进入慢失活的程度明显提高,其衰减时间常数ζ为7.93s±0.58s,WT为2.83±0.15s,统计学处理有显著差异(p<0.01)。 6.通过设计一系列protocal研究长时间预刺激后钠通道的恢复过程,预刺激时间在40ms到60s之间变动。40ms预刺激后,R675Q通道从快速失活中恢复的时间常数(5.77±1.62ms;n=6)与WT型(3.47±0.87ms;n=6)相似,统计学处理无显著差异(p>0.05)。1s预刺激后,R675Q从快速失活中恢复的时间常数(2.99±0.76ms;n=6)与野生型(2.48±0.22ms;n=6)统计学处理无显著差异;R675Q钠电流中间成份的恢复时间(357.08±17.08ms;n=6)慢于野生型(67.11±5.01ms;n=6)。60s预刺激后,中间成份的恢复过程与1s预刺激后相似,R675Q恢复时间(658.9±78.09ms;n=6)明显迟于WT(180.2±12.12ms;n=6);R675Q慢成份恢复时间(16.3±3.08s;n=6)也相对WT(6.96±0.8s;n=6)延长。 7.240s的预刺激后,用一系列的测试刺激来研究钠通道的恢复过程。R675Q中间成份恢复时间(654.9±93.5ms:n=6)慢于(273.9±48.2ms;n=6)。R675Q慢成份恢复时间(47.8±4.9s;n=6)慢于(21.3±2.4s;n=6)。 结论: 1.成功构建了周期性麻痹SCN4A基因R675Q突变的细胞模型。 2.转染基因后通过RT-PCR和Western—blot证实了目的基因和蛋白的表达。 3.R675Q突变提高了激活,但是对快速失活及失活后恢复没有明显影响;明显损害了慢性失活,使其慢失活和从慢失活中恢复时间延长;提示DⅡS4可能参与了通道激活及慢失活。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R746

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【参考文献】
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1 郭秀海,吴卫平,张雁华,王红斌,毛燕玲,朱克;应用变性高效液相色谱技术筛查一个正常血钾性周期性麻痹家系的SCN4A基因突变[J];中华医学杂志;2004年02期
【共引文献】
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1 杨宁;蓝东明;王永华;杨博;;白假丝酵母脂肪酶CaLIP5在毕赤酵母X33中的优化重组表达[J];安徽农业科学;2011年17期
2 李国庆;范松;裴建军;赵林果;高树峰;;黑曲霉外切葡聚糖酶基因密码子的优化及表达[J];南京林业大学学报(自然科学版);2012年04期
3 朱伟锋;蔡贵庆;黄艳梅;徐基清;区敬华;伍新尧;;SNP分型前的PAGE检测[J];生物技术;2006年05期
4 连英丽;蓝东明;杨博;王永华;;寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、原核表达及其结构分析[J];生物技术通报;2011年07期
5 张正平;杨江科;徐莉;刘云;闫云君;;扩展青霉脂肪酶基因克隆、密码子优化及表达[J];微生物学报;2010年02期
6 张黎;赵鹤云;徐莉;刘云;闫云君;;解脂耶氏酵母脂肪酶基因lip1的克隆、密码子优化及功能表达[J];微生物学报;2010年07期
7 任翔;卜碧涛;姚淇;邱昕;刘静宇;王擎;刘木根;;一中国正常血钾周期性麻痹家系中的SCN4A基因的T704M突变[J];遗传;2006年08期
8 郭秀海,吴卫平,张雁华,朱克;正常血钾型周期性麻痹SCN4A基因新突变的检测[J];中华神经科杂志;2004年03期
9 郭秀海,吴卫平,丁素菊,张雁华,朱克;家族性高钾型周期性麻痹的SCN4A基因突变[J];中华神经科杂志;2005年04期
10 郭秀海,吴卫平,张雁华,贾建平,朱克;正常血钾型周期性麻痹存在SCN4A基因V781I突变[J];中华医学遗传学杂志;2004年06期
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1 高楠;褶皱假丝酵母脂肪酶热稳定性改造的设计与抗氧化酶的人工模拟[D];吉林大学;2011年
2 郭秀海;周期性麻痹的临床及相关基因突变研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年
3 柯青;原发性低钾型周期性麻痹的离子通道基因突变及临床研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2006年
4 王海燕;荧光假单孢菌脂肪酶基因的克隆、改造及其在毕赤酵母中的表达[D];中国农业科学院;2006年
5 王敏;SEDT-PA致病基因WISP3突变体在软骨细胞中的表达及功能研究[D];中南大学;2006年
6 朱新红;CD59基因W40位点突变、真核表达与生物学活性研究[D];青岛大学;2008年
7 冯昱;周期麻痹性副肌强直—中国家系的临床和基础研究[D];中国医科大学;2007年
8 王艳君;角毛壳菌Chi58基因克隆与密码子优化及在毕赤酵母中的高效表达[D];哈尔滨工业大学;2009年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 邵韶;正常血钾型周期性麻痹SCN4A基因突变分析[D];山西医科大学;2011年
2 杨宁;白假丝酵母脂肪酶CaLIP5的重组表达及性质研究[D];华南理工大学;2011年
3 连英丽;寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、表达及生物信息学分析[D];华南理工大学;2011年
4 江雪青;皱褶假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶基因的克隆与表达[D];华中科技大学;2009年
5 于民;离子通道对低钾性周期性麻痹发病的影响[D];浙江大学;2001年
6 黄亮;黑曲霉A9葡萄糖氧化酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达[D];河北农业大学;2007年
7 林晴;Taq DNA聚合酶的改造及应用[D];厦门大学;2007年
8 陈祺;绿色木霉葡聚糖内切酶Ⅰ基因在大肠杆菌中的表达与分子改造[D];广西大学;2008年
9 韵晋琦;铜绿假单胞菌来源的脂肪酶的纯化与异源表达[D];中国农业科学院;2008年
10 郭明;美伐他汀生物合成酰基转移酶mlcH的克隆、表达及其定向突变研究[D];西南大学;2010年
【二级参考文献】
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1 郭秀海,吴卫平,朱克,王红斌,司艺玲,毛燕玲,黄旭升,沈定国,张雁华;正常血钾型周期性麻痹与高钾型周期性麻痹关系的基因研究[J];中华神经科杂志;2003年06期
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1 王永方;;周期性麻痹84例分析(摘要)[J];中国神经精神疾病杂志;1980年04期
2 郝存才,王瑜;甲亢合并周期性麻痹三例临床分析[J];内蒙古医学杂志;1994年02期
3 刘江,范生尧;周期性麻痹误诊1例报告[J];四川医学;1995年03期
4 韩磊,王元玲,黄吉光;甲状腺机能亢进症合并周期性麻痹17例临床分析[J];青岛医药卫生;1997年12期
5 张丽,史二栓;周期性麻痹3例误诊分析[J];包头医学院学报;1998年04期
6 赵咏莉!附属弋矶山医院内分泌科241001,陆美琴!附属弋矶山医院内分泌科241001;Graves病并发周期性麻痹16例分析[J];皖南医学院学报;2001年01期
7 周敏,王少娜;甲状腺功能亢进性周期性麻痹21例临床分析[J];河南实用神经疾病杂志;2002年01期
8 高展;低钾型周期性麻痹136例临床分析[J];江西医学院学报;2002年03期
9 周彦珍;甲亢合并低血钾周期性麻痹62例临床分析[J];张家口医学院学报;2002年03期
10 刘键,屈跃峰;甲状腺功能亢进合并周期性麻痹12例临床分析[J];中华全科医师杂志;2002年02期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 茆怀海;林宇新;刘萍;;药物致甲亢合并低钾周期性麻痹死亡1例[A];中国法医学会全国第十三次法医临床学学术研讨会论文集[C];2010年
2 郭秀海;吴卫平;朱克;张雁华;;低钾性周期性麻痹的快速鉴别与诊断[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
3 吴卫平;郭秀海;朱克;张雁华;;周期性麻痹相关基因突变研究[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
4 王琦;高志民;李洪钧;张娜;李靖;陶新江;;甲亢性周期性麻痹23例分析[A];第四届中国核学会省市区“三核”论坛论文集[C];2007年
5 马泽强;;原发性醛固酮增多症误诊分析——附一例报道[A];中国重汽科协获奖学术论文选编(2000-2001)[C];2002年
6 吴云成;谢雅英;赵永波;;低钾性周期性麻痹(附64例临床分析)[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
7 吴卫平;郭秀海;朱克;张雁华;;低钾型周期性麻痹相关基因突变检测[A];中华医学会第七次全国神经病学学术会议论文汇编[C];2004年
8 成建定;竞花兰;陈玉川;;低钾性周期性麻痹猝死的法医学鉴定[A];中国法医学最新科研与实践(二)——全国第七次法医学术交流会论文精选[C];2004年
9 黄遐;;放射性131碘治疗Graves病并发周期性麻痹的护理[A];第二届全国核素显像及治疗学术会议论文摘要汇编[C];2004年
10 陈森良;;碳酸锂联合~(131)I治疗合并周期性麻痹的Graves病的研究[A];中华医学会第九次全国核医学学术会议论文摘要汇编[C];2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 杜长明;周期性麻痹——来无影去无踪的“瘫痪”[N];中国医药报;2001年
2 索芳;“全身无力”的周期性麻痹[N];农村医药报(汉);2007年
3 吕斌;美餐后谨防患上“周期性麻痹”症[N];卫生与生活报;2006年
4 ;周期性麻痹的诊断要点[N];农村医药报(汉);2008年
5 副教授 魏开敏;为何血钾正常也可引发肌无力[N];卫生与生活报;2008年
6 ;周期性麻痹的治疗[N];农村医药报(汉);2008年
7 ;周期性麻痹的病因及发病机制[N];农村医药报(汉);2008年
8 魏开敏;高血钾亦可引起周期性麻痹[N];农村医药报(汉);2008年
9 觉非;钾:高低都有害[N];医药经济报;2001年
10 文娟;暴饮暴食会造成肌肉软瘫[N];中国中医药报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前4条
1 卫红艳;Graves病甲亢低钾周期性麻痹股四头肌活检的免疫组化研究及其与MICA基因微卫星多态性的关联[D];天津医科大学;2005年
2 郭秀海;周期性麻痹的临床及相关基因突变研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2004年
3 丁则昱;肌电图运动诱发实验对周期性麻痹的诊断价值研究[D];中国协和医科大学;2008年
4 吴磊;正常血钾型周期性麻痹SCN4A基因新突变R675Q的功能研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 邵韶;正常血钾型周期性麻痹SCN4A基因突变分析[D];山西医科大学;2011年
2 于民;离子通道对低钾性周期性麻痹发病的影响[D];浙江大学;2001年
3 袁梦华;Graves病甲亢低血钾倾向的临床研究及与HLA-DQA1基因多态性的相关关系[D];天津医科大学;2004年
4 殷方美;原发性低钾型周期性麻痹的临床特点及病理研究[D];天津医科大学;2011年
5 杨礼芳;住院Graves病患者临床分布特点探讨[D];中南大学;2007年
6 刘全生;非外伤性截瘫的临床研究[D];重庆医科大学;2007年
7 付春莉;~(131)I治疗Graves'甲亢的回顾性分析[D];山东大学;2008年
8 牛萍;以顽固性高血压为表现的原发性醛固酮综合症[D];武汉大学;2004年
9 曲华伟;肾上腺结节样增生性高血压的诊断与治疗[D];山东大学;2007年
10 刘惠杰;《黄帝内经》痿病研究[D];中国中医科学院;2008年
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