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《中国人民解放军军医进修学院》 2007年
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低氧预处理或HIF-1α基因修饰的成肌细胞移植治疗心肌梗死的实验研究

王凡  
【摘要】: 冠心病心肌梗死及其所引起的心力衰竭是目前成年人心血管疾病死亡的首要病因。近年来,针对冠心病局部心肌缺血情况,一些成体干细胞局部移植替代治疗展示出良好的应用前景。但是在移植治疗过程中,有许多问题有待于探索研究。为了解决如何体外扩增干细胞而得到足够的移植细胞数量,及如何体外调控干细胞使其能够更好的改善心功能,本课题进行了大胆的尝试:其一是选择了物理因素——低氧作为体外扩增成肌细胞(Skeletal Myoblasts,SkMs)的方法,将低氧预处理的SkMs移植治疗大鼠心肌梗死,评价心功能的变化情况并探讨低氧作为体外扩增SkMs的方法的可行性和有效性。其二是选择了与心肌缺血、血管新生密切相关的调控因子——低氧诱导因子-1α(hypoxia induciable factor 1α,HIF-1α)基因修饰SkMs,观察了基因修饰SkMs移植治疗大鼠心肌梗死的效果并探讨了其改善心功能的可能机制。 一、大鼠成肌细胞的分离、培养和鉴定 4~5周龄雄性Wistar大鼠颈椎脱位法处死,无菌条件下切取小腿后肌群约1cm~3肌肉,用混合酶消化法+连续贴壁法分离纯化SkMs,用SkMs的特异性Marker—Desmin鉴定,并进行Desmin阳性细胞计数,粗略估计分离培养细胞的纯度。结果表明,分离培养的SkMs生长状态良好,细胞纯度可达90%以上。我们已经建立了稳定的SkMs体外培养体系,为开展SkMs体外研究奠定了基础。 二、低氧对成肌细胞增殖的影响及HIF-1α的相关作用探讨 为了观察低氧对体外培养的大鼠SkMs增殖的影响,我们用Desmin阳性细胞数计算比较了在常氧、3%O_2和10%O_2的环境培养3天后原代SkMs的数量。结果显示:20%、3%、10%氧浓度组Desmin阳性的平均细胞数分别为416+10,633+32和1043+67,经过3%和10%低氧处理,SkMs的数目分别是常氧组的1.5和2.5倍,该结果表明,低氧能够明显促进SkMs体外增殖(P<0.05),10%的低氧环境更有利于SkMs的增殖。 为了探讨低氧促进SkMs增殖可能的机制,我们选择了具有良好SkMs特性的稳定细胞系小鼠成肌细胞系C_2C_(12)细胞,在常氧(20%O_2)、3%O_2、6%O_2、或10%O_2低氧环境中培养24、48、72h时,用血球计数板细胞计数法、BrdU掺入的细胞计数法、流式细胞术测定了细胞周期的方法观察了低氧对C_2C_(12)细胞增殖的影响:用PT-PCR和Western blot的方法检测了C_2C_(12)细胞在低氧或常氧环境中不同时间HIF-1αmRNA和蛋白的表达,用Western blot的方法分别检测了低氧或常氧条件下C_2C_(12)细胞胞浆和胞核HIF-1α蛋白表达。结果表明:低氧能够促进C_2C_(12)细胞增殖且10%O_2的促增殖的作用更加明显(P<0.01);C_2C_(12)细胞在常氧与低氧环境下均检测到HIF-1αmRNA和蛋白的表达,且HIF-1αmRNA或蛋白的表达水平在两种环境下无显著差异;常氧条件下C_2C_(12)细胞胞浆HIF-1α蛋白水平高于核HIF-1α蛋白水平,而低氧状态下,结果恰好相反。以上结果可能提示,低氧促进C_2C_(12)细胞增殖是通过氧浓度特异性调节HIF-1α蛋白核转位的增加,使HIF-1α进入细胞核中,在核中高度聚集,与HIF-1β亚基结合而活化,进而调节下游与细胞增殖相关的靶基因,促进C_2C_(12)细胞增殖。 三、低氧预处理或HIF-1α基因修饰SkMs移植治疗心肌梗死的实验研究 本研究用冠状动脉前降支结扎的方法制备大鼠心肌梗死的动物模型,观察评价了低氧预处理的SkMs或经HIF-1α基因修饰的SkMs局部移植治疗急性心肌梗死的可行性及其疗效。低氧预处理的方法是SkMs于移植前48h置入10%O_2的低氧温箱;基因修饰SkMs的方法是移植前48h用携带HIF-1α基因的重组Ad5腺病毒感染SkMs。移植细胞用BrdU进行示踪标记。实验分为六组:①假手术组:只开胸不做结扎血管、②DMEM组:造模后梗死区注射DMEM、③SkMs组:造模后梗死区注射SkMs、④Hy+SkMs组:造模后梗死区注射低氧(10%O_2)预处理的SkMs、⑤Ad/GFP+SkMs组:造模后梗死区注射感染了HIF-1α空载体的SkMs、⑥Ad/HIF-1α+SkMs组:造模后梗死区注射感染了HIF-1α的SkMs。所有实验组在移植后28d用血流动力学的方法评价心功能,用组织切片病理染色的方法观察心肌梗死及梗死周围组织瘢痕的形成、胶原的沉积、血管的新生等;DMEM组、SkMs组、Ad/HIF-1α+SkMs组的实验大鼠在细胞移植后1、4、7、14、28d,取心肌梗死及梗死周围区域心肌组织,用RT-PCR的方法检测VEGF 及其受体Flk-1的表达。结果表明:28d后经低氧预处理的SkMs移植治疗心肌梗死与单纯SkMs移植组在心功能和胶原的沉积、血管的新生中没有明显差异。HIF-1α基因修饰的SkM移植组心脏左心室收缩舒张功能较其他实验组均得到更为明显的改善,纤维组织数量、Ⅰ型胶原沉积、瘢痕形成面积较其他各组减少,新生血管数量较其他各组增多,结果具有显著性差异(P<0.05)。Ad/HIF-Iα+SkMs组心肌的VEGF及其受体Flk-1 mRNA的表达明显上调(P<0.05),并在14d时仍能检测到Flk-1 mRNA的表达。由以上结果可知,低氧能够作为一种安全有效简便的方法体外扩增SkMs,为移植提供足够的细胞数量,具有重要的临床意义;HIF-1α基因修饰后的SkMs移植更加明显的改善了梗死后的心功能,HIF-1α诱导的血管新生可能参与了梗死后心功能的改善,为基因联合细胞治疗损伤性疾病提供了实验基础。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2007
【分类号】:R542.22

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