血卟啉单甲醚光动力学疗法抑制增生性瘢痕的实验研究

【摘要】： 目的: 增生性瘢痕(HS)是成纤维细胞异常增殖和细胞外基质过度沉积的纤维化疾病,是医学界亟待解决的难题。本文研究以血卟啉单甲醚(HMME)为光敏剂的光动力学疗法(PDT)对瘢痕成纤维细胞(HSF)增殖与功能的影响并初步探讨其作用机制,在动物瘢痕模型上观察HMME-PDT的生物学效应,为临床应用HMME-PDT防治增生性瘢痕提供实验依据。 方法: 1.HSF对HMME的吸收特性及HMME-PDT对其增殖效应的研究:取原代培养的第4～6代HSF,经流式细胞仪(FCM)检测孵育浓度(0～40μg/ml)和孵育时间(0～120min)对HSF细胞吸收HMME的影响;MTT法检测HMME-PDT对HSF细胞存活率的影响;银染法检测HSF中核仁组成区相关嗜银蛋白(AgNORs)的表达情况;FCM分析细胞周期的变化。 2.HMME-PDT对HSF中TGF-β_1/Smad信号通路的影响:用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HMME-PDT后HSF分泌至上清液的TGF-β_1蛋白表达量;用Smad3-FITC标记后在荧光显微镜上观察细胞内Smad3的荧光强度;将细胞分为对照组、光敏剂组、照光组和HMME-PDT组,经Western-blot方法检测各组细胞浆内TGF-β_1、磷酸化和非磷酸化Smad3、Smad7蛋白的表达量。 3.HMME-PDT诱导HSF凋亡效应的研究:Hoechst33258染色后在荧光显微镜上观察HMME-PDT后HSF细胞形态学变化;Annexin V-FITC-PI双染后经FCM检测HMME-PDT后HSF细胞凋亡率和坏死率;将HSF爬片后分为对照组、HMME-PDT组和Z-DEVD-FMK抑制剂组,Caspase3-FITC-PI染色后在荧光显微镜上观察各组细胞内Caspase3的荧光强度;收集各组细胞在active-Caspase3-FITC单染后经FCM检测active-Caspase3阳性细胞百分率;收集各组细胞在PI单染后经FCM检测细胞凋亡率。 4.HMME-PDT对兔耳瘢痕的效应研究:建立兔耳瘢痕模型后,将瘢痕块分为不同组别,照光功率密度为20mW/cm~2,光敏剂剂量为10mg/kg,分别在给药后即刻、0.5、1、3h给予2.5、5、10、20J/cm~2的能量密度照光,治疗后第10天用游标卡尺测量并计算瘢痕增生指数(HI);HE染色后观察瘢痕厚度、细胞及胶原分布等形态学变化;观察HMME-PDT后瘢痕中微血管数量、形态变化,采用Weidner计数方法,计算平均微血管密度(MVD);运用透射电镜观察兔耳瘢痕增生块中成纤维细胞超微结构的变化。 结果: 1.在一定孵育浓度范围内(0～40μg/ml),HSF细胞对HMME的吸收量随孵育浓度的增高和孵育时间的增加而增大。实验范围内的HMME-PDT对HSF细胞的杀伤效应与孵育浓度和激光能量密度正相关;HMME-PDT能够减少HSF细胞中AgNORs的含量,使I.S%值降低;HMME-PDT降低HSF增殖指数,改变各期细胞的分布比例,抑制S期DNA合成,使细胞滞留在G_0/G_1期。 2.HSF分泌至细胞上清液的TGF-β_1蛋白含量较高,而HMME-PDT后降低;HSF合成的TGF-β_1蛋白水平高,HMME-PDT后HSF中的TGF-β_1和磷酸化Smad3蛋白含量减少,Smad7蛋白含量增加,光敏剂组和照光组中上述蛋白的表达无显著改变;PDT不能改变HSF内Smad3蛋白表达量,但其在细胞内的分布发生变化,进入细胞核的Smad3蛋白减少。 3.HMME-PDT治疗后细胞核染色质高度凝聚,呈团块颗粒状,或呈波纹状、折缝样改变;AnnexinV-FITC-PI双染结果表明PDT后凋亡率显著升高,并伴有细胞坏死的发生,但组内坏死率低于凋亡率;对照组和Z-DEVD-FMK抑制剂组HSF的细胞浆中Caspase3-FITC荧光微弱,PDT组荧光显著增强;对照组active-Caspase-3阳性细胞百分率低,HMME-PDT组上升,Z-DEVD-FMK组降低;PI染色分析表明对照组凋亡率低,PDT组的凋亡率显著升高,Z-DEVD-FMK组的凋亡率低于PDT组,但仍然显著高于对照组。 4.在本研究的兔耳增生性瘢痕块中,静脉注射HMME10mg/kg后30min,给予功率密度为20mW/cm~2,能量密度为5J/cm~2的630nm红光照射能对瘢痕块产生较理想的抑制效应;对照组兔耳瘢痕块真皮层显著增厚,血管分布丰富,HMME-PDT组瘢痕块厚度下降,MVD显著减少;在透射电镜下观察到对照组中有大量HSF,胞浆内粗面内质网丰富,高尔基体发达,线粒体增加,PDT组胞浆内粗面内质网萎缩且数量减少,核蛋白体有不同程度的脱颗粒和解聚,胞质中见较多游离核糖体,线粒体肿胀,嵴溶解。 结论: 1.HSF对HMME的吸收随孵育浓度和孵育时间的增加而增加,HMME-PDT处理HSF时,光敏剂孵育浓度和激光能量密度是影响细胞存活率的重要因素,PDT改变各期细胞的分布比例,抑制细胞增殖。 2.HMME-PDT能够阻止TGF-β_1的信号经由Smad蛋白传向细胞核,改变TGF-β_1、磷酸化Smad3和Smad7在HSF细胞水平的表达,使细胞增殖及胶原合成有关的靶基因得不到激活,从而抑制HSF增殖和胶原合成。 3.HMME-PDT诱导HSF发生的凋亡效应与Caspase-3的激活密切相关,但该凋亡效应并不依赖于Caspase-3,可能与AIF等因子的释放或其它信号途径的激活有关。 4.HMME-PDT对兔耳增生性瘢痕的生物学效应是一个光动力综合作用的结果,与光敏剂的剂量和激光照光时间、给药后至照光的时间间隔及能量密度密切相关。在瘢痕形成早期,HMME-PDT能够抑制兔耳HSF的增殖,破坏蛋白合成场所,并能诱导部分细胞进入凋亡途径,HMME-PDT有可能成为瘢痕防治的有效方法。