收藏本站
《中国人民解放军军医进修学院》 2008年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

表皮细胞去分化形成表皮干细胞的基础研究

孙晓艳  
【摘要】: 目的:从建立表皮细胞去分化模型入手,比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞在功能和生物学特性等方面的异同点,为实现无延迟、无瘢痕完美修复及皮肤组织的再生提供新的实验参考。 方法:采用免疫组织化学的方法探寻胎儿皮肤中的表皮干细胞(epidermal stemcells,ESCs),研究不同发育时期ESCs在胎儿皮肤中分布与迁移。采用改良的Ⅳ型胶原铺板选择黏附法分离培养人ESCs,观察其形态及增值分化的特点,并进行细胞免疫组织化学鉴定。同时,提取小鼠胚胎发育中期组织液,模拟表皮干细胞壁龛微环境,采用免疫组织化学、免疫荧光染色、流式细胞检测及RT-PCR技术研究表皮干细胞在此环境中的表型变化,探讨表皮干细胞周围生长微环境在表皮干细胞“命运”决定过程中的作用。此外,本研究在前期的工作基础上,建立表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型,采用免疫组织化学、MTT法、免疫荧光染色、流式细胞技术、扫描及透射电镜检测技术、RT-PCR、Western-blot及TRAP法再次验证表皮细胞通过去分化途径形成机体内源性去分化来源的表皮干细胞,参与皮肤组织的创伤修复与再生。同时,从细胞表型、超微结构及生物学功能等方面比较去分化来源的表皮干细胞和机体自身来源的表皮干细胞二者之间的异同点。 结果:表皮干细胞在从基底层经棘层和颗粒层到角质层的分化迁移过程中,经历了有序的成熟模式,这一过程与角蛋白的程序性表达密切相关;毛囊的发生、发育不仅与ESCs的增殖分化有关,同时受到毛乳头的诱导作用。改良的Ⅳ型胶原选择黏附法能够高效的分离表皮中的干细胞。这些细胞具有干细胞的形态特点表达α_6整合素,β_1整合素,CK19,CK14,p63,Nestin及PCNA为阳性,而CK10染色为阴性;激光共聚焦检测显示α_6整合素和CD71在表皮干细胞中的分布存在着区域性差异,可以作为区分标志之一,为ESCs及其亚群的分离与鉴定提供实验参考。此外,流式细胞检测显示胚胎组织提取液作用后α_6~+CD71~-表达细胞由细胞总数的22.49%减少至10.92%,而α_6~+CD71~+、α_6~-CD71~+表达细胞则分别由诱导前的62.29%及0.19%增加至诱导后的68.34%及4.51%。RT-PCR结果表明胚胎组织提取液作用后,表皮干细胞中β_1整合素、CKl9、CK10表达增强,而CK14表达减弱。本文在前期工作的基础上,建立了表皮细胞去分化研究的体内、体外实验模型,免疫组织化学染色结果显示去基底层的超薄皮片CK19和β_1整合素染色为阴性;而移植第3、5、7d后,存活皮片内CK19和β_1整合素染色阳性的细胞重新出现,并且呈多层分布;流式细胞仪检测结果表明移植前后α_6~+CD71~-和α_6~+CD71~+细胞比例有明显差异。人细胞系HEKa体外培养6~7代时,开始出现老化迹象。细胞免疫组织化学检测结果显示此时细胞表达CK10为强阳性,而β_1整合素、CK19表达为阴性,CK14则呈现弱阳性染色。在浓度为100ng/ml的bFGF诱导培养36~48h后,老化的HEKa细胞之间开始出现新生的表皮干细胞样克隆。这些细胞体积较小,为圆梭形,形态均一、折光性强、胞质近中央处有圆形核,核浆比大,因此称之为去分化来源的表皮干细胞(dHEK细胞)。dHEK细胞不但具有克隆形成能力,而且具有强大的分裂增殖能力。随着培养的延长,dHEK细胞克隆的面积逐渐增大,相互连接成片,并且和周围的HEKa细胞之间相互嵌合形成表皮嵴样结构。免疫组织化学检测发现bFGF诱导培养后,实验组细胞中β_1整合素、CK19和CK14的表达增强;CK10作为终末分化细胞的标志,在bFGF诱导组中的表达明显降低。流式细胞检测分析显示bFGF作用后,实验组CK14表达阳性的细胞与对照组相比明显增多(分别为87.14%和67.26%)。CK19表达阳性的细胞也由原来的15.74%增加至被检测细胞总数的74.77%。而bFGF诱导作用后,被检测细胞中表达CK10阳性的细胞数量较对照组明显下降(分别为4.56%和98.56%)。此外,RT-PCR和Western-blot检测结果同样再次支持了表皮细胞去分化的现象。在bFGF作用后,表皮细胞重新程序化,并获得其前体干细胞的某些潜在能力,表达表皮干细胞的一些未分化蛋白。另外,表皮干细胞和去分化来源的dHEK细胞之间有两个显著的相同点:(1)二者都表达表皮干细胞的表面标志,如β_1整合素、α_6整合素和CK19等;(2)二者都存在着α_6整合素和CD71表达的区域性分布差异。此外,表皮干细胞和dHEK细胞之间的差异点有:(1)CD71-PE和α6 integrin-FITC直标双色荧光流式检测分析显示表皮干细胞和去分化来源的dHEK细胞之间存在着细胞亚群的分布差异;(2)hTERT在表皮干细胞和去分化而来的干细胞中存在着亚细胞定位差异。 结论:ESCs并非真正静止的未分化细胞,而是一种已经进入分化状态但是仍具有多向分化潜能的干细胞,其增殖分化行为不但受到自身程序化基因表达的影响,同时又受到其所处的微环境的调控。bFGF能够诱导表皮细胞在体外发生去分化,去分化而来的表皮干细胞与ESCs相比具有更加强大的分裂增殖能力,可以作为种子细胞应用于皮肤创伤修复与再生的相关研究之中。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:R329

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 胡森;表皮细胞逆分化成表皮干细胞的形态学证据[J];中国危重病急救医学;2001年12期
2 付小兵;李建福;盛志勇;;表皮干细胞:实现创面由解剖修复到功能修复飞跃的新策略[J];感染.炎症.修复;2002年04期
3 王小兵;王晓健;张宝林;;创伤愈合中bFGF bFGF受体的研究进展及其对表皮干细胞的影响[J];山西医药杂志;2007年07期
4 罗鸿;陶泽璋;;鼓膜表皮干细胞的研究及应用前景[J];听力学及言语疾病杂志;2006年02期
5 赵喜彬;杨松林;;表皮干细胞用于瘢痕治疗的研究进展[J];组织工程与重建外科杂志;2009年06期
6 孙晓庆!100037北京,付小兵!100037北京,盛志勇!100037北京;表皮干细胞[J];中华创伤杂志;2000年10期
7 程大胜 ,夏照帆,唐洪泰,田建广,王皓;一种表皮干细胞检测方法的建立[J];解放军医学杂志;2003年06期
8 刘虎仙;贾赤宇;付小兵;谢晓繁;;表皮干细胞来源、分布及其在创面愈合中的作用[J];中华创伤杂志;2006年03期
9 周彪;王凌峰;;表皮干细胞的特征与烧伤创面修复的研究进展[J];中国冶金工业医学杂志;2007年02期
10 田田;李英春;;胚胎干细胞源性表皮干细胞的研究进展[J];组织工程与重建外科杂志;2008年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 张杨;李秀兰;华云旗;;表皮干细胞与毛囊干细胞生物学特性比较[A];第十五次全国中西医结合疡科学术交流会论文汇编[C];2011年
2 李孝建;沈雁;张志;曾耀英;李延仓;杨小红;;鼠表皮干细胞与角质形成细胞蛋白质组差异表达的初步研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
3 廖立新;陈刚泉;李国辉;李剑;;以表皮干细胞及脱细胞真皮构建组织工程皮肤[A];第四届全国烧伤救治专题研讨会烧伤感染救治新进展论文汇编[C];2006年
4 王冰梅;葛香连;林程琳;宋颖楠;张彦定;;诱导人表皮干细胞向成釉质细胞分化[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
5 朱飞滨;刘德伍;张红艳;彭燕;钟清玲;李勇铁;;P物质联合表皮干细胞促进糖尿病创面愈合与神经再生[A];“细胞活动 生命活力”——中国细胞生物学学会全体会员代表大会暨第十二次学术大会论文摘要集[C];2011年
6 白晓智;张战凤;赵周婷;蔡维霞;石继红;汤朝武;朱雄翔;胡大海;;热损伤后表皮细胞培养上清诱导脂肪干细胞向表皮干细胞表型转分化的实验研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
7 陶克;陈璧;丁国斌;谢松涛;王洪涛;胡大海;;联合应用3-甲基-1-异丁基黄嘌呤、胰岛素、地塞米松对人胎儿表皮干细胞的诱导分化作用[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
8 钟清玲;刘繁荣;刘德伍;;表皮干细胞向皮肤附件诱导分化研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
9 谢晓繁;刘虎仙;付小兵;贾赤宇;;表皮干细胞分离和鉴定的研究进展[A];2005'中国修复重建外科论坛论文汇编[C];2005年
10 彭燕;彭青;蔡爱英;刘德伍;钟清玲;蓝蔚;;表皮干细胞联合脱细胞真皮构建人工皮肤促进创面愈合的实验研究[A];中华医学会烧伤外科学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 张献怀;我国创伤修复研究取得新进展[N];中国医药报;2009年
2 张献怀;我国创伤修复研究和临床治疗获新进展[N];大众科技报;2009年
3 张献怀;我国创伤修复研究和临床治疗取得新进展[N];科技日报;2009年
4 本报通讯员 张献怀 本报记者 仇方迎;“返老还童”有望梦想成真[N];科技日报;2001年
5 张献怀;创伤修复研究发现三种生物学现象[N];健康报;2009年
6 ;我国学者率先发现人体表皮细胞存在逆分化现象[N];中国高新技术产业导报;2002年
7 记者 涂端玉 通讯员 陈景荣 钟志勇;巨型老鼠体内注有马骝基因[N];广州日报;2007年
8 张晓亭;核酸的美容功效[N];保健时报;2005年
9 第四军医大学口腔医院 张勇杰田洪涛;人造皮肤走进临床[N];健康报;2008年
10 王侠;两种梨树病害的诊治[N];河南科技报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙晓艳;表皮细胞去分化形成表皮干细胞的基础研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
2 尹德龙;表皮干细胞在不同外界因素下对其生物学特性的影响及机制研究[D];华中科技大学;2012年
3 胡信雷;表皮细胞的生物反应器培养及其创面递呈[D];浙江大学;2011年
4 蔡飒;非外源性基因干扰诱导表皮细胞去分化及再生汗腺的临床研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2008年
5 李娟;Kruppel样因子4(KLF4)在小鼠表皮干细胞中的表达和功能研究[D];华中科技大学;2011年
6 王新文;利用组织工程皮肤研究表皮干细胞在增生性瘢痕中的防治作用[D];第四军医大学;2006年
7 丁国斌;人胎儿表皮干细胞的分离培养、基因转染及向毛囊的定向分化[D];第四军医大学;2004年
8 郭永峰;人表皮细胞去分化的实验研究[D];中国医科大学;2007年
9 廖明德;人表皮干细胞复合裸鼠脱细胞真皮支架构建组织工程皮肤及移植的实验研究[D];广西医科大学;2009年
10 王联群;hTERT基因在人表皮干细胞中的表达与调控研究[D];南昌大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 费阳;去分化来源表皮干细胞的诱导及应用研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2009年
2 陈兰;龟板有效成分对胎鼠表皮干细胞凋亡的影响[D];广州中医药大学;2011年
3 陈季玲;急性β射线皮肤损伤创面及其表皮干细胞变化的实验研究[D];南华大学;2012年
4 李艳霞;蚕豆保卫细胞和和表皮细胞液泡内含颗粒物性质比较与分析[D];中国农业大学;2005年
5 陈萌;免疫荧光双标法应用于小鼠表皮干细胞分子标记的筛选[D];山东大学;2011年
6 詹日兴;一氧化氮在烧伤后表皮干细胞离巢迁移中作用的实验研究[D];第三军医大学;2012年
7 李云剑;培养基血清浓度对人表皮干细胞增殖分化的影响[D];南京医科大学;2010年
8 朱飞滨;P物质联合表皮干细胞促进糖尿病创面愈合与神经再生的实验研究[D];南昌大学;2011年
9 孙薇;P311促进烧伤创面表皮干细胞迁移的实验研究[D];第三军医大学;2012年
10 赵周婷;人脂肪干细胞向表皮细胞表型转化的研究[D];第四军医大学;2010年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026