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《中国人民解放军军医进修学院》 2010年
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NK、T混合淋巴细胞联合顺铂或西妥昔单抗对NSCLC的体外实验研究

李瑾昱  
【摘要】: 【目的】明确NK、T混合淋巴细胞(Mixture of NK and T lymphocytes cells,NKTm)对非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)细胞的体外抑制作用,以及与顺铂(cisplatin, DDP)或与西妥昔单抗(cetuximab, C225)的联合应用效应,为临床治疗提供实验依据。探讨C225在NSCLC治疗中的作用机制;对抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)的影响因素进行研究,为C225对NSCLC的个体化综合治疗提供理论支持。 【方法】第一部分以肺巨细胞癌PLA-801D为靶细胞,MTT法检测不同效靶比及不同作用时间下NKTm细胞对靶细胞的抑制率,并检测NKTm细胞以不同时序联合DDP对靶细胞的抑制率。第二部分:1、检测NSCLC细胞的分子特性:以A549、H1975、PLA-801D细胞为研究对象,免疫组化法检测表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)蛋白表达水平;荧光原位杂交法(Fluorescence in situ hybridization,FISH)检测EGFR基因扩增水平;测序法检测Kras基因、EGFR基因突变情况。2、CCK-8及流式细胞仪分别检测C225对3株肺癌细胞的体外抑制率及诱导凋亡情况,并通过基因芯片检测C225对A549细胞作用后基因表达的变化。3、采用CCK-8法检测C225介导NKTm细胞的ADCC效应对A549细胞的抑制率以及影响ADCC活性的因素:1) NKTm细胞用Anti-CD16单抗封闭,比较干预组与对照组NKTm细胞ADCC活性:2)将pEGFR-EGFP质粒用Nucleofector核转染技术导入A549细胞,比较EGFR蛋白表达量对ADCC活性的影响;3)基因测序法检测NKTm细胞FCGR3 A (Fc fragment of IgG, low affinityⅢa, receptor)基因多态性,比较NKTm细胞FCGR3A基因多态性对ADCC活性的影响。 【结果】NKTm细胞对PLA-801D细胞具有明显的生长抑制作用,抑制率与效靶比呈正相关,作用4 h抑制率最大(P0.05)。NKTm细胞与DDP联合应用具有协同效应,NKTm细胞应用4 h后再用DDP的协同抑制效果最强。 A549、H1975、PLA-801D细胞的EGFR免疫组化结果均为弱阳性,EGFR基因扩增FISH检测为阴性。A549细胞Kras基因12密码子突变(GGTAGT),H1975细胞EGFR基因第21外显子突变(L858R),PLA-801D细胞为Kras和EGFR基因野生型。生长抑制和凋亡诱导结果均表明,C225对A549细胞的作用比对PLA-801D细胞强(P0.05);而C225对H1975细胞的凋亡诱导作用比PLA-801D细胞弱(P0.05)。C225对A549细胞作用后有关细胞周期、细胞迁移、肿瘤耐药及抗肿瘤免疫等方面的一系列基因表达可发生改变。 C225联合NKTm细胞对A549细胞具有协同抑制效应。Anti-CD16抗体封闭后的NKTm细胞与C225联合应用的抑制率显著下降(P0.05),且抑制率与单独NKTm细胞组的抑制率间无差异,表明协同效应主要依靠ADCC作用。转染pEGFR-EGFP质粒后的A549细胞EGFR表达呈强阳性,且多为膜阳性,NKTm细胞的ADCC作用对转染组的抑制率显著高于未转染组(P0.05)。NKTm细胞FCGR3A-158V/V表型者比V/F和F/F表型者对A549细胞的抑制率高(P0.05),而V/F表型与F/F表型间差异无统计学意义。 【结论】NKTm细胞在体外能够显著抑制NSCLC细胞的生长,与DDP联合应用具有协同效应,NKTm细胞应用4 h后再用DDP的协同抑制效应最强。Kras基因12密码子突变(GGTAGT)的A549细胞对C225比野生型PLA-801D细胞更敏感,而EGFR基因第21外显子突变(L858R)的H1975细胞对C225诱导的凋亡作用不敏感。C225作用后的A549细胞有关细胞周期、细胞迁移、肿瘤耐药及抗肿瘤免疫等方面的一系列基因表达发生变化,这可能与C225治疗NSCLC的作用机制相关。C225与NKTm细胞联合应用对NSCLC细胞具有协同抑制效应,且此效应主要依靠ADCC作用实现。C225介导NKTm细胞的ADCC活性可能与靶细胞EGFR蛋白表达水平和NKTm细胞FCGR3A基因多态性有关。
【学位授予单位】:中国人民解放军军医进修学院
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:R734.2

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