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《第三军医大学》 2012年
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青蒿琥酯对NSCLC抗瘤及增强厄洛替尼体内外抗瘤活性的实验研究

马虎  
【摘要】:背景与目的: 目前,在包括我国在内的多数国家和地区,肺癌已占男性各种癌症发病率的首位。近年来分子靶向治疗作为治疗肿瘤的新方法,以其技术含量高,针对性强,不良反应小,疗效肯定被广泛关注,发展比较迅速。然而分子靶向药物疗效维持时问短,中位疾病进展时间为6~8个月,且靶向治疗存在不能完全清除病灶,迟早有耐药发生和肿瘤复发的问题。因此,寻找及开发抗瘤作用强,毒副作用小而价廉的药物,是我们亟待解决的首要问题,也是国内外学者努力研究的方向。青蒿琥酯是一种毒副作用小的抗恶性疟疾药物,已有研究发现其具有体内抗瘤活性并已应用于转移性黑色素瘤的临床治疗;进一步研究表明,青蒿琥酯可以干预细胞的主要信号通路、抗转移、 DNA损伤、细胞周期调控和逆转多药耐药。我们因而推测:青蒿琥酯与肿瘤分子靶向治疗药物联合应用有望提高后者的疗效。为此,本研究拟在观察青蒿琥酯对人非小细胞肺癌(NSCLC)细胞株A549细胞增殖的作用基础上,进一步观察其与分子靶向药物厄洛替尼联合应用的效果,最后探讨其对分子靶向药物厄洛替尼耐药的影响及机制。希望通过本研究为改善NSCLC的治疗效果提供新的思路。 材料和方法: 1.青蒿琥酯对肺腺癌细胞系A549的影响及机制研究:培养人NSCLC细胞株A549,加入不同浓度的青蒿琥酯,用MTT(3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide)检测细胞的增殖率,流式细胞仪检测药物处理48h后细胞的凋亡率和周期分布。Real-time RT-PCR和western-blot检测EGFR(Epidermal growth factorreceptor)、 Akt(serine-threonine protein kinase)和ABCG2(ATP-binding cassette G2)mRNA及蛋白的表达。 2.青蒿琥酯增强厄洛替尼对非小细胞肺癌细胞体内外抗瘤效应及机制:培养人非小细胞肺癌细胞株A549,加入不同浓度的青蒿琥酯、厄洛替尼或联合两药,用MTT检测细胞的增殖率,流式细胞仪检测加药后48h细胞凋亡率和细胞周期分布。Real-timeRT-PCR和western-blot检测EGFR、 Akt和ABCG2mRNA和蛋白的表达。并观察药物对裸鼠移植瘤生长抑制情况。 3.青蒿琥酯逆转厄洛替尼耐药及其机制:按浓度递增法诱导出耐厄洛替尼的人肺癌细胞A549/ER,加入不同浓度的青蒿琥酯、厄洛替尼或联合两药,用MTT检测细胞的增殖抑制率,流式细胞仪检测给药48h后细胞凋亡率和细胞周期分布以及细胞内多柔比星蓄积倍数。高效液相色谱检测细胞内厄洛替尼的浓度。Real-time RT-PCR和western-blot检测EGFR、 Akt和ABCG2mRNA和蛋白的表达。 4.青蒿琥酯增加厄洛替尼对CD133~+ABCG2~+细胞的抗瘤活性:用免疫磁珠法从人肺癌细胞株A549中分选出CD133~+ABCG2~+细胞,经干细胞培养基悬浮培养,流式鉴定细胞表型;加入不同浓度的青蒿琥酯、厄洛替尼或两药联合,用MTT检测细胞的增殖率,流式细胞仪检测药物处理48h后细胞内多柔比星的荧光强度。Real-timeRT-PCR检测Bim-1、OCT4和ABCG2mRNA的变化情况。 结果: 1、青蒿琥酯能时间和剂量依赖性地抑制A549细胞的增殖。青蒿琥酯100μM作用96h,其抑制率达到最大的93.5%。流式细胞Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡分析表明,青蒿琥酯作用48h,随浓度的增加,细胞凋亡率逐渐增加,与对照组相比差异具有显著性(P0.05)。用药48小时后细胞ABCG2mRNA和蛋白的表达均较对照组降低(P0.05),同时EGFR和Akt的磷酸化水平下降。 2、青蒿琥酯联合厄洛替尼对A549细胞的增殖抑制作用较单药明显;青蒿琥酯联合厄洛替尼作用48h,凋亡细胞显著增多,细胞周期阻滞于G0/G1期。联合用药48小时后细胞ABCG2mRNA和蛋白的表达均较单药组降低,同时EGFR和Akt的磷酸化水平下降。青蒿琥酯可以抑制裸鼠移植瘤的生长,与厄洛替尼联合治疗可显著抑制移植瘤的生长(P0.05)。 3、青蒿琥酯能降低耐药细胞A549/ER的IC50值;流式检测细胞凋亡分析表明,青蒿琥酯联合厄洛替尼作用48h,凋亡细胞显著增多而细胞周期阻滞于G0/G1期。耐药细胞A549/ER内多柔比星的荧光强度较A549细胞降低,青蒿琥酯与烟曲霉菌C一样可以增加细胞内的多柔比星蓄积。高效液相色谱检测提示耐药细胞内厄洛替尼的浓度降低,青蒿琥酯与烟曲霉菌C一样可以增加细胞内厄洛替尼的浓度。联合用药48小时后细胞ABCG2mRNA和蛋白的表达均较单药组降低。同时EGFR和Akt的磷酸化水平下降。 4、青蒿琥酯能使厄洛替尼对CD133~+ABCG2~+A549细胞的IC50值降低,流式检测耐药细胞内多柔比星的荧光强度降低,青蒿琥酯与烟曲霉菌C一样可以增加细胞内的多柔比星荧光强度。联合用药48小时后CD133~+ABCG2~+A549细胞的Bim-1、OCT4和ABCG2mRNA的表达均较单药组降低(P0.05)。 结论: 1、青蒿琥酯可以剂量依赖性地抑制非小细胞肺癌细胞的增殖,增加细胞的凋亡,其机制与下调EGFR/Akt信号通路有关,且能下调ABCG2的表达。 2、青蒿琥酯可增加厄洛替尼对肺癌A549细胞及其移植瘤增殖的抑制,其机制可能与P13K/Akt通路的抑制及ABCG2表达的下调有关。 3.青蒿琥酯可以逆转耐药肺癌细胞对厄洛替尼的耐药,其机制是通过抑制ABCG2和Akt信号通路来实现的。 4.青蒿琥酯可以增加厄洛替尼对肺癌干细胞样细胞CD133~+ABCG2~+细胞的抗瘤作用。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R734.2

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