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《第三军医大学》 2012年
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Numb分子在肠粘膜屏障形成中的作用及其机制研究

杨永涛  
【摘要】:背景&目的 肠黏膜屏障包括:机械屏障、免疫屏障、化学屏障和生物屏障。肠粘膜粘液屏障是上皮细胞表面覆盖的由粘蛋白形成的水化的凝胶样粘液,而肠黏膜上皮屏障是肠上皮本身及其紧密连接构成的在体内外环境之间形成一种组织学屏障,它们都具有机械性的保护作用。Numb分子因其能够不对称的分布到干细胞的两个子代细胞,并能够通过抑制Notch信号通路而使子代细胞具有不同的“命运”而引起人们的广泛关注。既往研究显示Numb表达在包括乳腺,肺,睾丸,唾液腺等在内的大多数组织上,但Numb在肠上皮细胞的表达及其功能目前还没有报道。我们预实验发现Numb并非表达在肠隐窝底干细胞上,而是普遍的表达在沿着隐窝-绒毛轴的所有上皮细胞上。既往研究发现,Numb能够调节细胞的分化,调节细胞粘附,细胞迁移和细胞极性。在肠粘膜上皮细胞上,Numb是否能够通过抑制Notch通路促进肠上皮细胞粘蛋白Muc2的分泌及肠粘膜屏障的形成,以及Numb能否通过调节肠上皮细胞间顶端连接复合体(Apicaljunctional complex,AJC)的组装而维持肠粘膜上皮细胞屏障的完整性目前还不清楚。 围绕以上问题,本研究揭示了Numb分子与Notch通路相关分子Hes1,Hath1的表达定位关系。通过干扰Numb分子的表达揭示了其在肠上皮细胞中对Notch通路的抑制作用,及其对肠上皮细胞LS174T细胞杯状细胞表型的影响。利用Caco-2单层细胞模型,揭示了Numb在肠上皮单层细胞屏障形成中的作用,并揭示了其通过抑制肌球蛋白轻链磷酸化及改变细胞微丝骨架的结构影响上皮细胞屏障通透性的作用机制。 方法 1.采用RT-PCR和Western blot的方法检测Numb-PRRL和Numb-PRRS在肠上皮细胞系和肠粘膜细胞的表达,免疫组织化学检测Numb,Hes1,Hath1,Muc2在小鼠肠粘膜上皮细胞分布,揭示它们在肠粘膜上皮细胞的定位关系,并通过AB染色显示其与杯状细胞的定位关系。 2.构建干扰质粒pRNAT-U6.1-shRNA-Numb,转染LS174T细胞,筛选稳定转染细胞克隆,荧光素酶质粒pGa981-6检测干扰Numb表达对Notch活性的影响,及其下游靶基因Hes1,Hath1表达的影响。 3.MTT实验检测干扰Numb表达对细胞增殖的影响,RT-PCR,Western blot及免疫荧光染色检测Numb对Muc2表达的影响,PAS染色检测Numb对LS174T细胞粘液分泌的影响。 4.RT-PCR和Western blot的方法检测Numb在肠上皮细胞系Caco-2中的表达,免疫荧光染色检测其与粘附连接分子ZO-1,E-cadherin及Par3的表达定位关系,免疫共沉淀检测其与E-cadherin及Par3之间的相互作用。 5.干扰Numb分子的表达,TEER和FITC-Dextran渗透实验检测Numb分子在肠单层上皮细胞屏障通透性中的作用。钙转换实验和TNF-a/INF-γ刺激实验验证Numb在AJC组装和维持细胞连接完整中的作用。 6.免疫荧光染色检测抑制Numb表达对钙转换试验前后Caco-2细胞F-actin结构的影响,Western blot检测在生理和病理条件下,抑制Numb表达对细胞连接相关蛋白ZO-1,Occludin,E-cadhern,β-catenin,Claudin-1,Claudin-2的表达变化,并检测对Caco-2细胞肌球蛋白轻链磷酸化水平的影响。 7.DSS诱导小鼠溃疡性结肠炎动物模型,HE染色检测结肠组织形态变化,免疫荧光染色检测炎症条件下Numb在结肠上皮细胞的表达变化。 结果 1.Numb-PRRL和Numb-PRRS亚型在肠上皮细胞系和肠粘膜上皮细胞内都有表达, Numb与Notch通路相关分子Hes1,Hath1在肠粘膜上皮细胞存在共定位关系,与Muc2和AB染色阳性的杯状细胞也有共定位关系。 2.序列测定证实pRNAT-U6.1-shRNA-Numb成功构建,转染并经G418筛选出稳定细胞克隆,荧光素酶质粒pGa981-6检测发现Numb能够抑制Notch通路活性,抑制Hes1表达,促进Hath1表达。 3.Numb抑制肠上皮细胞增殖;促进LS174T表达杯状细胞分子标志物Muc2的表达,PAS染色发现Numb促进LS174T细胞粘液的分泌。 4.肠上皮细胞系Caco-2表达Numb,Numb与ZO-1,E-cadherin及Par3分子共定位,IP检测发现Numb与E-cadherin和Par3之间存在相互作用。 5.抑制Numb分子的表达能够增加Caco-2上皮细胞屏障通透性。钙转换和TNF-a/INF-γ刺激实验证实Numb在AJC组装和维持细胞连接完整性中发挥作用。 6.抑制Numb表达能够改变钙转换试验前后Caco-2细胞F-actin的结构;Numb对正常和炎症条件下Caco-2细胞内ZO-1,Occludin,E-cadhern,β-catenin,Claudin-1的蛋白水平没有影响,但能够升高Claudin-2的水平;Numb能够抑制Caco-2细胞肌球蛋白轻链磷酸化。 7.HE染色发现DSS成功诱导小鼠结肠炎症反应,炎症条件下Numb在结肠上皮细胞的表达减少,且在细胞内分布紊乱。 结论 Numb能够通过抑制Notch通路促进肠上皮细胞粘蛋白Muc2的表达及粘液的分泌,参与肠粘膜粘液屏障的形成;同时Numb通过抑制肌球蛋白轻链的磷酸化,调节肠上皮细胞间AJC的组装,维持肠粘膜上皮细胞屏障的完整性,参与肠粘膜机械屏障的形成。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R363

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