TBI患者淋巴细胞核—质基因组早期响应及其临床意义研究

【摘要】：背景与目的： DNA分子是辐射作用的敏感靶位，辐射后短时间内即可发生胞内核DNA及胞质mtDNA的基因结构及功能改变。已有体外研究发现：辐射引起淋巴细胞核DNA基因组的表达改变及mtDNA的突变（如mtDNA4977bp common deletion,简称CD），均为很有价值的潜在分子生物剂量计，但缺乏体内研究的支持。不仅如此，研究辐射早期损伤生物效应与胞内基因组表达的相互关系，还有利于在转录水平变化阐明人体受到辐射后发生损伤的分子机制，为采取进一步的医学干预及个体化治疗提供有力的实验依据。 本课题以需行骨髓移植全身照射（total body irradiation，TBI）预处理的急性淋巴细胞性白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL）患者为在体辐射模型，从淋巴细胞核基因组的表达变化及mtDNA（包括mtDNA含量及CD）的改变两个角度进行研究。第一部分采用基因芯片技术，并利用生物信息学方法，研究ALL患者TBI预处理后早期淋巴细胞核基因组表达变化，并分析与辐射剂量的关系，在此基础上，深入探讨影响TBI预处理疗效的关键信号通路，旨在从核基因组水平，筛选出ALL患者辐射早期淋巴细胞的差异表达基因，深入分析影响TBI敏感性及有效性的基因群，为进一步阐明急性辐射损伤的体内分子机制提供方向。第二部分通过深入分析mtDNA含量及CD比例的改变与ALL患者TBI辐射剂量之间的关系，阐述辐射早期mtDNA的数量及结构变化特点，评估其作为辐射分子剂量计的可能。综上所述，本研究为探索TBI患者淋巴细胞核-质基因组早期分子响应及其可能的临床意义提供了实验和理论依据。 方法： 1.采集6例临床确诊为B型急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患者分别经4.5Gy、9GyTBI后24h的外周血淋巴细胞；对照组为该6例ALL患者TBI前2h（0Gy）的外周血淋巴细胞。分别提取总RNA并质检合格后（2例因RNA质检不合格被剔除），逆转录成cDNA与Agilent人基因组表达谱芯片进行杂交、扫描。提取芯片数据并进行标准化处理后，应用生物信息学方法进行后续分析。其中，差异基因比较及聚类分析可了解辐射后基因表达的变化及其与辐射剂量之间的关系（P0.05，false discovery rate，FDR10%）。层次聚类表达趋势分析（series tests of cluster, STC）则是利用辐射差异基因的显著性水平，来筛选出显著的表达趋势。STC-gene ontology (GO)分析、STC-pathway分析及基因共表达网络（gene co-expression network）分析分别用于寻找显著趋势中的重要GO及pathway，并筛选其中的关键基因。最后挑选出12个代表性基因，应用荧光定量PCR方法进行验证。 2.采集26例临床确诊为急性淋巴细胞白血病患者分别经4.5Gy、9Gy TBI后24h的外周血淋巴细胞；对照组为该26例ALL患者TBI前2h（0Gy）的外周血淋巴细胞。另取39例健康志愿者的外周血淋巴细胞作为健康人未经辐射的对照组，比较全身照射前健康人与ALL患者外周血淋巴细胞中mtDNA及CD的基础水平。经DNA提取、质粒鉴定后，以-actin、hypervariable region2(HVR2)及CD三组质粒标准品为外参照（分别代表nDNA、mtDNA及CD），分别进行TaqMan-MGB探针的荧光定量PCR实验，检测辐射前后淋巴细胞中mtDNA及CD的含量。 结果： 1. TBI与ALL患者外周血淋巴细胞核基因组表达改变的关系 ①找到478个随剂量变化有显著差异表达的基因，聚类分析提示，除1例4.5Gy辐射的样本外，上述基因组合可将不同剂量的TBI辐射样本区分开来。 ②应用STC方法得到上述差异基因的三个显著性表达趋势（P0.01）。趋势1代表基因表达随TBI剂量的增加不断上调，共包含77个基因(P=2E7)；趋势2代表基因表达随TBI剂量的增加不断下调，共包含64个基因(P=5E4)；趋势3代表随着剂量增加基因表达先不变而后下调，共包含85个基因(P=5E3)。 ③应用STC-GO分析上述显著趋势的基因，提示：随着辐射剂量的增加，神经传导、蛋白水解、表皮生长因子受体信号通路以及一些代谢途径相关分子的表达不断增强；而DNA重组、泛素依赖的蛋白代谢途径以及一些应激反应相关分子的表达逐步减弱。 ④应用STC-pathway分析上述趋势的基因，提示：随着辐射剂量的增加，造血系统、T细胞受体信号通路以及初级免疫反应的相关基因（如CD3D，CD8A等）表达不断增强。此外，当辐射剂量由4.5Gy增加至9Gy时，同种异体移植物抗拒及免疫抗宿主病（Graft-versus-host disease，GVHD）两条通路的相关基因（如FASLG，HLA-DRB1）的表达逐步减弱。 ⑤基因共表达网络分析提示：相互作用强度高的基因多属于泛素依赖的蛋白代谢途径及转录途径。挑选出CYP4F11, PCNT,LOC286467, PSMD14, SENP3, CIZ1, GZMA,EPS8等8个相互作用强的基因中，PSMD14和SENP3属于泛素依赖的蛋白水解途径。 ⑥挑选12个代表性基因，用荧光定量PCR方法进行验证，与芯片数据结果保持一致。 2. TBI与ALL患者外周血淋巴细胞mtDNA改变的关系 ①分别比较健康志愿者及ALL患者辐射前的mtDNA含量及CD比例基础水平，均无显著差异（P＞0.05）。 ②TBI后ALL患者外周淋巴细胞内mtDNA含量及CD比例改变 经4.5Gy及9GyTBI辐射后，样本中的mtDNA含量显著增加（4.5Gy vs.0Gy=0.043,9Gy vs.0Gy=0.025）；而CD含量显著降低（4.5Gy vs.0Gy=0.038,9Gy vs.0Gy=0.011）。 ③TBI后每个ALL患者外周淋巴细胞内mtDNA含量及CD比例的相对改变 经4.5Gy TBI辐射后，病人外周淋巴细胞的mtDNA含量平均增加了1.87倍，经9Gy TBI后，增至2.13倍，均有显著差异（P0.001）。经4.5Gy和9GyTBI后，病人的CD比例平均减少至0.78及0.61倍，均有显著差异（P0.001）。比较不同剂量TBI后的每例患者，其mtDNA含量（P=0.041，9Gy vs.4.5Gy）和CD比例（P0.001，9Gyvs.4.5Gy）均有统计学差异。 ④辐射后mtDNA含量与CD比例的关系 将所有样本中的CD比例不等分为含量高和含量低的两组（2/3为含量高组，1/3为含量低组），可发现不同剂量辐射后，mtDNA含量与CD比例之间有一定的负相关（4.5Gy TBI后， P=0.037；9Gy TBI后，P=0.048）。 ⑤年龄在19~56岁的26例病患中，年龄大的患者，其外周血淋巴细胞中的mtDNA含量相对较高。 结论： 1.我们的小样本量探索性研究发现：较之中等剂量（4.5Gy）辐射样本，差异表达的基因组合更适合区分大剂量TBI（9Gy）后的ALL患者外周淋巴细胞样本,提示该方法有成为区分中高剂量辐射的生物剂量计的可能。 2.应用恰当的生物信息方法，在转录水平发现并重点探讨了泛素依赖的蛋白水解途径及免疫移植物抗宿主病这两条影响急淋病患TBI预处理疗效的关键信号通路，初步阐述了TBI预处理方案的辐射生物学机制，及其疗效优于非TBI预处理的原因。 3.辐射早期外周淋巴细胞中的mtDNA含量增加，同时其中的CD比例降低，提示mtDNA的改变（mtDNA含量与CD比例）有成为分子辐射剂量计的潜在价值。