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《第三军医大学》 2012年
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BCAR1在NSCLC中表达的临床意义和对A549细胞生物学行为的影响

黄伟  
【摘要】:背景与目的 肺癌是肿瘤导致死亡的主要原因,每年世界范围内新增135万患者。由于肺癌病因复杂,治疗棘手,且很难早期发现,预后往往较差。因此,研究肺癌形成机制,从而改善肺癌的诊断和治疗具有重要的意义。 乳腺癌抗雌激素耐药蛋白1(breast cancer anti-estrogen resistance1,BCAR1),又名P130cas,作为CAS蛋白家族一员,参与调控细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭、分化等。目前已在乳腺癌,前列腺癌、卵巢癌和胶质母细胞瘤发现BCAR1过表达。在乳腺癌和卵巢癌中,发现BCAR1与预后呈负相关。Dorssers用ELISA检测2593例乳腺癌患者,发现BCAR1的血清水平显著增高,并且与预后和无瘤生存时间呈负相关;Alpa等发现卵巢癌BCAR1过表达提示临床预后差,同时沉默BCAR1可抑制肿瘤细胞的增殖,促进癌细胞凋亡;此外有研究报道,BCAR1可通过血管内皮生长因子(VEGF)的受体NRP1促进胶质母细胞瘤增殖。 BCAR1在肿瘤形成中发挥关键作用,而目前尚未见关于BCAR1与非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer)相关报道。鉴于此,本课题拟通过检测NSCLC血清和癌组织中BCAR1表达;构建慢病毒介导的BCAR1的siRNA载体,感染A549细胞,建立稳定表达细胞株;观察沉默BCAR1对A549细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期的变化,从而探讨BCAR1在NSCLC发生发展中的作用,为BCAR1成为NSCLC新的潜在靶向治疗的靶点提供理论基础和实验依据。 方法 1.通过ELISA方法检测NSCLC患者血清中BCAR1表达情况,了解其与NSCLC的临床病理联系。 2.采用免疫组化和组织芯片技术检测NSCLC组织中BCAR1表达情况,以及与NSCLC临床病理联系和预后的联系;同时检测P-P38和P38,分析两者与BCAR1之间联系。 3.采用Tunel检测NSCLC组织中肿瘤细胞的凋亡指数(AI)情况,并分析与BCAR1之间联系。 4.设计合成4个siRNA(small interfering RNA)针对人BCAR1靶序列:PLVT350、PLVT351、PLVT352、PLVT353,分别插入经酶切后的pMagic4.1慢病毒载体,经转化DH5α感受态细胞,采用PCR扩增和DNA测序筛选出阳性克隆。阳性克隆扩增和抽提后,与辅助质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,进行慢病毒包装、浓缩和滴度测定。感染A549肺癌细胞,荧光显微镜下观察感染效率,实时荧光定量PCR检测干扰效率,Western blot检测BCAR1蛋白表达情况。 5.应用克隆形成实验检测正常组(未转染组)、阴性对照组和慢病毒干扰组A549细胞增殖能力变化;使用划痕实验和Transwell实验比较三组细胞迁移和侵袭能力变化;采用流式细胞仪分析三组细胞细胞周期分布的变化;应用Western blot检测三组细胞中P38和P-P38蛋白的变化。 结果 1. NSCLC组血清中BCAR1水平显著高于肺良性肿瘤组和正常对照组(P0.01),而与肺结核组无显著差异(P0.05);BCAR1血清水平与性别、年龄和淋巴结转移无关(P0.05);与鳞癌和腺癌病理类型无关(P0.05),支气管肺泡癌BCAR1血清水平低于其它类型的NSCLC(P0.05);BCAR1血清水平随着临床分期增加有逐渐递增的趋势;BCAR1血清水平在切除肺癌组织后降低。肺结核组中BCAR1血清水平高于正常对照组和肺良性肿瘤组(P 0.05),并与结核病变的直径呈正相关(rs=0.92, P 0.01),空洞型肺结核血清中BCAR1水平高于结核瘤(P 0.01),结核病变切除后下降;肺良性肿瘤组与正常对照组血清中BCAR1水平无显著差异(P0.05)。经受试者工作特征曲线(ROC)检验,单独检测血清BCAR1不能区分NSCLC和肺结核(P0.05),但是结合肿瘤标志物(CEA、CA19-9、CA125)检测可区分NSCLC和肺结核(P0.01)。 2. NSCLC癌组织中BCAR1蛋白阳性率为98.6%(69/70),癌旁肺组织中仅有3例弱阳性,阳性率为4.2%(3/70);肺良性肿瘤中无阳性表达,NSCLC癌组织与癌旁组织和肺良性肿瘤比较均有非常显著差异(χ2=143.93,P 0.01)。NSCLC中BCAR1表达在不同年龄、性别、淋巴结转移,TNM分期和病理类型表达无统计学差异(P>0.05),而与肿瘤分化程度呈负相关(χ2=13.639,P 0.01)。BCAR1与P-P38呈显著正相关(P0.01),与凋亡指数呈负相关(P0.05)。用Kaplan-Meier生存曲线经Log-rank检验发现,BCAR1高表达组预后比低表达组生存时间短,两组间有显著差异(P 0.05)。 3.成功构建4个BCAR1慢病毒干扰载体,并测定它们病毒滴度值:PLVT350为3.45×108TU/ml、PLVT351为2.13×108TU/ml、PLVT352为3.01×108TU/ml、PLVT353为2.47×108TU/ml;慢病毒载体对A549肺癌细胞感染效率达90%以上;除PLVT350,其它3个均为有效靶点,PLVT351和PLVT353敲出率为82%,PLVT352为73%;Westernblot证实,与正常A549细胞比较,PLVT351稳定表达A549细胞株非常显著减少BCAR1的表达(P0.01)。 4.正常组克隆形成率为(78.34±10.23)%、阴性对照组为(77.43±12.34)%,慢病毒干扰组(34.31±7.12)%,慢病毒干扰组与正常组和阴性对照组比较显著减少(P0.05);正常组细胞穿膜数(79.54±18.2)个、阴性对照组细胞(77.81±16.21)个,慢病毒干扰组(31.25±9.83)个,慢病毒干扰组与正常组和阴性对照组比较显著减少(P0.05);正常组划痕愈合率(61.34±6.54)%、阴性对照组(58.45±4.07)%,慢病毒干扰组细胞(29.45±5.03)%,慢病毒干扰组与正常组和阴性对照组比较显著降低(P0.05);正常细胞组G1期为(57.31±3.2)%、阴性对照组(59.61±3.51)%、慢病毒干扰组(78.64±4.5)%,慢病毒干扰组与正常组和阴性对照组比较显著增高(P0.05);慢病毒干扰组P-P38蛋白表达显著减低(P0.05),而P38在三组间无显著差异(P0.05)。 结论 1.BCAR1在NSCLC患者血清水平高于正常对照组和良性肿瘤组,并随临床分期升级有逐渐增高趋势,在切除肿瘤后,其血清水平逐渐下降。可作为了解两种疾病进展和判断治疗效果的辅助指标。 2.BCAR1在NSCLC组织中表达显著高于癌旁组织和肺良性肿瘤,并与分化程度和预后呈负相关,而与年龄、性别、淋巴结转移、TNM分期和病理类型无显著差异;与P-P38呈正相关,与凋亡指数呈负相关。可作为非小细胞肺癌诊断和判断预后重要指标。 3.成功构建针对BCAR1的siRNA慢病毒干扰载体,并沉默BCAR1基因,获得稳定表达A549细胞株。为今后进一步探索BCAR1对肺癌生物学行为的影响,打下实验基础。 4.沉默BCAR1的表达可以显著抑制A549的增殖、迁移和侵袭、导致G1期阻滞和P-P38蛋白表达下调。表明BCAR1是NSCLC治疗潜在的有效靶点。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R734.2

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