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《第三军医大学》 2012年
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乙型肝炎病毒载体表达的APOBEC3C抗病毒作用研究

李东  
【摘要】:乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染的主要临床表现是慢性乙型肝炎,迄今慢性乙型肝炎的治疗效果很不理想,所以科研人员都在积极探索新的治疗策略。Natsoulis等于90年代初率先提出了一种全新的抗病毒策略:利用衣壳蛋白靶向灭活病毒(capsid targeted viral inactivation,CTVI),他们将这个方法应用于治疗逆转录病毒的实验研究,这个方法的主要原理是构建抗病毒蛋白与衣壳蛋白重组形成的融合蛋白,病毒组装时很多衣壳蛋白单体聚合形成衣壳蛋白,融合蛋白可以被病毒当做真的衣壳蛋白单体被组装到病毒核心颗粒中,这样融合蛋白携带的抗病毒蛋白就可以直接作用于核心颗粒内部的病毒核酸,干扰核酸合成使之发生变异失去作用或直接破坏清除病毒核酸,从而达到控制病毒复制的目标。 2001年Beterams和Nassal将这个方法扩展到HBV的实验研究。他们在HBV核心蛋白羧基端通过linker连接核酸酶(staphylococcal nuclease,SN)。构建SN与核心蛋白的融合蛋白,这种被命名为Core-SN的融合蛋白被装配到病毒核心颗粒中。在与HBV质粒共转染人肝癌细胞后,提取上清液检测HBV DNA,发现DNA滴度下降了95%,实验显示Core-SN对核心蛋白和RNA形成核心颗粒没有影响,然而干扰了核心颗粒内部DNA的合成。这个实验也有不足之处:钙离子浓度高的情况下SN才能发挥功能,然而钙离子浓度在细胞内比较低,也就是说SN对细胞内的病毒没有作用,只是对分泌到细胞外的病毒发挥作用,当然就更不能阻止细胞质内的HBV DNA进入细胞核转化为cccDNA,所以我们应当寻找能在细胞内直接发挥抗HBV作用的物质。 载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme-catalyticpolypeptide,APOBEC)是近年来新发现的具有脱氨基作用的一类酶,可以使腺嘌呤(adenine,A)或胞嘧啶(cytosine,C)脱氨基分别转化为次黄嘌呤(inosine, I)或尿嘧啶(uracil,U),即A→I或C→U。2007年Thomas报道,APOBEC3C(A3C)对HBV具有抑制作用,HBV核心蛋白与A3C复合体非常稳定,A3C可以使多数的新合成HBVDNA基因组出现很多鸟嘌呤(guanine,G)→腺嘌呤突变,即G→A。这些研究结果表明HBV非常容易受到内源性人脱氨酶的影响,并提示A3C是机体固有的抗HBV宿主反应因子。然而A3C不容易进入核心颗粒内部。为此我们利用核衣壳导向的病毒灭活策略构建核心蛋白与A3C的融合蛋白,在核心蛋白组装时将A3C带进核心颗粒内部以便其更有效的发挥抗病毒作用。 本实验分为两部分:第一部分我们研究A3C蛋白独立的抗HBV作用和机制。在第二部分我们利用核衣壳导向的病毒灭活策略构建核心蛋白与A3C的融合蛋白,观察Core-A3C融合蛋白的抗HBV作用和机制。主要方法是应用电化学发光免疫法(electrochemiluminescence immunoassay,ECLIA)检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平;应用Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液中HBV DNA观察抗病毒作用及pCH-LJ3-A3C在辅助质粒存在下的复制能力;应用3D-PCR技术扩增核心蛋白相关的HBV DNA,测定HBV DNA序列,研究Core-A3C融合蛋白抑制病毒机制;应用免疫细胞化学方法研究融合蛋白在细胞中的定位。 主要研究结果如下: 第一部分:复制缺损型HBV载体表达A3C抗HBV作用。应用PCR技术扩增目的基因A3C,经过Xho I和BSP1407I双酶切替换pCH-LJ3-hrGFP中的hrGFP基因,构建质粒pCH-LJ3-A3C,质粒经酶切和测序鉴定正确。质粒pCH-LJ3-A3C与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞系。首先,应用ECLIA法检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示pCH-LJ3-A3C组HBsAg表达水平为对照组的104.4%%±2.25%;HBeAg表达水平为对照组的98.65%±0.85%,与对照组相比,均无统计学差异。随后,应用Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液HBV DNA,观察pCH-LJ3-A3C的抗病毒作用。结果显示pCH-LJ3-A3C可以抑制细胞浆内病毒DNA,使HBV DNA减少30%,pCH-LJ3-A3C可以抑制上清液中子代病毒颗粒使HBV DNA减少39%。之后,为了研究pCH-LJ3-A3C能否在辅助质粒帮助下恢复复制能力,pCH-LJ3-A3C与pCH-3142共转染HepG2细胞系,Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液HBVDNA。结果显示裂解液和上清液均检出病毒DNA。最后,为了研究其抑制病毒机制,应用3D-PCR技术扩增核心颗粒有关的HBV DNA,与pGEM-T测序载体连接,每组选取50个克隆测序。结果回报pCH-LJ3-A3C对新合成的HBV DNA发挥编辑功能产生了G→A的变异,总共36个克隆出现G→A的变异,G→A变异总数目达982。 第二部分:HBV载体表达核心蛋白与A3C融合蛋白抗HBV作用。应用PCR技术扩增目的基因A3C,经过BstE II和Acor13H I双酶切,插入载体质粒pdssX中,构建质粒pCH-Core-A3C,质粒经酶切和测序鉴定正确。pCH-Core-A3C与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞系。首先,应用ECLIA法检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平。结果显示pCH-Core-A3C组HBsAg表达水平为对照组的97.82%±1.37%,HBeAg表达水平为对照组的97.16%±0.86%,与对照组相比无统计学差异。随后,应用Southern blotting方法检测细胞裂解液和上清液HBV DNA,观察pCH-Core-A3C的抗病毒作用。结果显示pCH-Core-A3C可以抑制细胞浆内病毒DNA,使HBV DNA减少84%,pCH-Core-A3C可以抑制上清液中子代病毒颗粒使HBV DNA减少91%。之后,为了研究其抑制病毒机制,应用3D-PCR技术扩增核心颗粒有关的HBV DNA,与pGEM-T测序载体连接,每组选取50个克隆测序。结果回报pCH-Core-A3C对新合成的HBV DNA发挥编辑功能,产生了大量的G→A的变异,总共48个克隆出现G→A的变异,G→A变异总数目达2416。最后,应用免疫细胞化学方法研究融合蛋白在细胞中的定位。结果显示Core-A3C融合蛋白主要定位于细胞浆。 综合前两部分研究我们得出主要研究结论如下: 1.成功构建了HBV载体表达核心蛋白与A3C融合蛋白质粒pCH-Core-A3C;复制缺损型HBV载体表达A3C质粒pCH-LJ3-A3C。 2.pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C质粒对细胞培养上清中HBsAg和HBeAg的表达水平没有影响。 3.pCH-Core-A3C转染HepG2细胞系,细胞免疫化学显示Core-A3C融合蛋白主要定位于细胞浆。 4.pCH-LJ3-A3C在辅助质粒pCH-3142提供包装时形成了完整的HBV颗粒。 5.与野生型HBV质粒pCH-3093共转染HepG2细胞系,Southern blotting方法检测发现pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均可以抑制细胞裂解液和细胞上清液HBVDNA,且pCH-Core-A3C抑制病毒复制作用明显优于pCH-LJ3-A3C。 6.应用3D-PCR技术扩增核心颗粒有关的HBV DNA并克隆至pGEM-T载体,每组选取50个克隆测序,pCH-LJ3-A3C和pCH-Core-A3C均对新合成的HBV DNA发挥编辑功能产生了G→A的变异,且pCH-Core-A3C的编辑作用明显优于pCH-LJ3-A3C。 总之,我们构建了表达Core-A3C的HBV载体,发现其对野生型HBV具有较强的的编辑作用,同时还能在辅助病毒存在时形成子代病毒,为下一步的动物试验及基因治疗奠定了良好的基础。将来在人体内应用时,有望实现“一次性治疗”获得持久的抗HBV作用。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R512.62

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【参考文献】
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