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《第三军医大学》 2012年
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Ars2/miR-21信号通路参与调节胆管癌增殖侵袭能力的初步研究

何谦  
【摘要】:研究背景与目的: 胆管癌是肝胆外科常见的恶性肿瘤之一,近年来该肿瘤发病率还在不断上升,尤其是肝内胆管癌上升最为明显。胆管癌的生物学行为主要是原位浸润生长,黄疸往往是其首发症状,外科切除是最主要的治疗方式。但胆管癌常常难以被早期发现,因而治疗效果欠佳。如果胆管癌能被早期发现和诊断,将极大的提高该疾病的治疗效果。最近的研究发现,microRNA-21(miR-21)在胆管癌的组织样本和细胞系中均表达上调,且具有较好的诊断敏感性和特异性,可以做为胆管癌的诊断标志物。然而microRNA的检测并没有在普通医院中得到广泛开展,因此我们需要进一步探索引起miR-21过表达的相关调控因素,以寻找更为合适的诊断标志。 砷化物抑制蛋白2(Arsenide inhibition protein2,Ars2)最初是在仓鼠细胞抗砷化物中毒的cDNA库中被筛选出来,科学界至今对它的认识还十分有限。许多的线索都提示Ars2可能在microRNA的产生过程和RNA干扰系统的维护中起着重要作用,而且该蛋白与细胞增殖能力也有重要关系。因此,我们猜测Ars2可能在CCA中表达增多,并影响miR-21及其下游信号蛋白的表达。PTEN和PDCD4这两个抑癌基因作为明确的miR-21调控目的蛋白已在包括胆管癌在内的多种肿瘤细胞中得到了广泛的研究,它们在恶性肿瘤中表达下降从而影响了肿瘤的增殖侵袭等生物学行为。基于以上的研究背景,在本课题研究中我们希望探讨Ars2是否在胆管癌的组织样本和细胞系中表达升高,以及Ars2能否通过miR-21影响其下游抑癌蛋白的表达进而影响胆管癌细胞的增殖侵袭能力。 材料与方法: 一、组织标本与细胞系:西南医院肝胆外科进行的胆管癌根治术中获取胆管癌及癌旁样本共18例,患者年龄51~67岁,平均56.78±5.91岁,其中男性11例,女性7例,肝内胆管癌和肝外胆管癌各9例。所有患者术后病理报告均证实胆管癌诊断。胆管癌及正常胆管上皮细胞共3株:QBC939胆管癌细胞系为西南医院肝胆外科自建,来源于肝门部胆管癌患者;RBE肝内胆管癌细胞系购于中国科学院细胞库;HIBEC人类胆管上皮原代培养细胞购自美国模式培养物集存库(American type culture collection,ATCC)。 一、采用免疫组织化学染色的方法,同时检测18例胆管细胞癌及癌旁组织标本中Ars2、PTEN、PDCD4三种蛋白的表达,分析它们在胆管细胞癌及癌旁组织中的表达差异及相互之间的相关性。 二、利用qRT-PCR和Northern blots法检测样本中miR-21的表达。组织和细胞样本中Ars2, PTEN和PDCD4的mRNA表达水平用罗氏公司的qRT-PCR系统检测。 三、利用Sigma-Aldrich公司购买的慢病毒包装的两个短发卡RNA序列shArs2-1,2及不含干扰序列的同种慢病毒作为空载体对照,转染QBC939和RBE胆管癌细胞,MTS细胞增殖实验、裸鼠成瘤实验、Western blots、qRT-PCR及细胞免疫荧光法观察干扰Ars2蛋白表达后细胞的增殖、侵袭能力变化及对下游分子表达的影响。 四、利用Sigma-Aldrich公司购买的Has-mir-21mimics以及一个不能影响人类基因表达的非人类microRNA作为阴性对照,按照说明书以100nM的浓度共转染已转染shArs2的QBC939和RBE胆管癌细胞,观察外源性过表达miR-21对下游分子表达的影响。 五、利用GeneCopoeia公司半合成法所构建的Ars2全长序列过表达及空对照质粒,转染QBC939和HIBEC细胞,观察过表达Ars2对miR-21、PTEN及PDCD4等下游分子的影响及细胞增殖能力的变化,并行免疫共沉淀实验观察外源性Ars2质粒过表达的蛋白能否与相关功能蛋白Drosha酶及CBP-80结合。 结果: 一、在18例胆管癌及癌旁样本中,免疫组化结果显示Ars2在胆管癌细胞中的表达较癌旁胆管上皮细胞显著升高,而PTEN和PDCD4则相反,卡方检验均有统计学差异。而在所有胆管癌及癌旁中观察Ars2与PTEN或PDCD4的表达情况,卡方检验结果其间具有显著的表达差异(P0.01,n=36)。qRT-PCR结果发现,Ars2mRNA和miR-21在所有胆管癌样本中表达均较癌旁升高(P0.01,n=18),其中Ars2mRNA表达量能够很好的区分胆管癌和癌旁组织,敏感性为95%,特异性为100%,ROC曲线下面积为0.995。而PTEN和PDCD4mRNA的表达在胆管癌和癌旁间未见显著差异(PTEN: P=0.937, PDCD4: P=0.653, n=18)。线性回归分析上述结果进一步发现在所有样本中,Ars2mRNA的表达与miR-21的表达间存在显著的相关性(R2=0.469, P0.001,n=36)。然而上述关系在Ars2/PTEN/PDCD4和miR-21/PTEN/PDCD4之间均未见存在。以上结果显示符合Ars2对PTEN及PDCD4的调控是通过miR-21在转录后水平上的调控的猜测。 二、干扰Ars2蛋白表达后,胆管癌细胞增殖能力下降,且下降程度与两个不同shRNA克隆的干扰能力相一致。Transwell实验结果也提示转染shArs2-2干扰Ars2后QBC939细胞的侵袭能力减弱。 三、qRT-PCR和northern blots实验发现干扰Ars2表达后QBC939和RBE胆管癌细胞中miR-21的表达下降,Western blots、RT-PCR和免疫荧光实验发现,PTEN和PDCD4的蛋白表达升高,它们变化程度均与不同干扰序列的干扰能力相关,而mRNA水平无变化。继而在干扰Ars2后的细胞中共转染miR-21mimics,PTEN和PDCD4的蛋白再次下降,结果提示干扰Ars2对PTEN和PDCD4的影响可能是通过miR-21实现的。 四、QBC939和RBE细胞转染Ars2全长序列质粒后,western blots检测Ars2蛋白表达升高,但PTEN和PDCD4的表达无变化,qRT-PCR和northern blots检测miR-21的表达也无明显改变。我们进一步行免疫共沉淀实验的结果提示,外源性过表达的Ars2能够与更多的Drosha蛋白结合,但不能结合更多的CBP80,提示单独过表达Ars2可能并不能促进胆管癌和胆管上皮细胞中miR-21的成熟表达。 结论: 在本课题的研究中,我们首次发现了Ars2在胆管癌细胞中表达升高,且具有诊断学意义。Ars2与miR-21在胆管癌细胞中的表达之间存在相关性。在QBC939和RBE胆管癌细胞中干扰Ars2能够通过抑制miR-21的表达上调抑癌基因PTEN和PDCD4的表达,从而抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭能力,然而单独过表达外源性的Ars2并不能观察到相反的结果。虽然Ars2仍是一个尚未研究得十分清楚的蛋白,但从我们的工作结果可以看出,它可以通过miR-21信号通路影响胆管癌的增殖、侵袭等生物学行为。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R735.8

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