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ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块中EMMPRIN和uPA的表达及阿托伐他汀干预的研究

梁星  
【摘要】:研究背景及目的 急性冠脉综合征(acute coronary syndrome,ACS)是心血管疾病患者发生心脏事件的主要原因,其发生的主要机制为不稳定斑块(Vulnerable plaque)的破裂并继发血栓,从而导致急性的血流减少或中断。不稳定性斑块的主要病理特征为:薄的偏心性纤维帽,富含脂质的粥样坏死中心,斑块周围大量炎症细胞的浸润。既往研究证实基质金属蛋白酶(metalloproteinases,MMPs)能降解纤维帽基质,使斑块失去稳定性,从而导致斑块破裂。MMPs是影响易损斑块薄纤维帽的细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)降解过程的关键因子。由于MMPs在动脉粥样硬化斑块内巨噬细胞、平滑肌细胞内高表达,并起到降解细胞外基质作用,被证实与动脉粥样硬化、ACS发生有着密不可分的联系。随着研究深入,作为诱导MMPs产生及分泌的细胞外基质金属蛋白酶诱导因子(extracellular matrix metalloproteinase inducer,EMMPRIN)被证实在人动脉粥样硬化斑块的血管内膜、血管平滑肌细胞以及斑块内高表达。动脉粥样硬化患者的旋切斑块染色表明,在斑块易破裂的肩部及巨噬细胞大量浸润处有EMMPRIN的表达。不仅如此,还有研究发现,EMMPRIN在急性心肌梗死患者体内表达增强,它刺激单核细胞/巨噬细胞表达MMP-9、平滑肌细胞表达MMP-2,而在稳定型心绞痛患者体内无过表达。诸多研究证实MMPs及其上游因子-EMMPRIN在促进基质的降解、导致ACS的发生等方面同样起着极其重要的作用。尿激酶型纤溶酶原激活物(Urokinase-typeplasminogen activator,uPA)是纤溶酶原系统的重要组成部分,其致动脉粥样硬化的作用正得到新的认识:在动脉壁局部起到促使基质降解、细胞粘附、细胞迁移增殖、细胞因子调节等作用。还可在多种细胞因子的刺激下直接参与到动脉粥样硬化的血管重塑过程中。Quemener在研究肿瘤细胞的侵袭性过程中发现,EMMPRIN通过刺激MMP2、MMP9、uPA的表达提高了肿瘤细胞的侵袭能力。在这个研究中,EMMPRIN的过表达刺激了uPA的分泌,MMP2、MMP9的作用与其参与新生血管的形成有关。Joachim Kienast发现:人冠状动脉内uPA的含量与粥样硬化病变的存在和严重性相关。且有研究发现,EMMPRIN和uPA在冠心病患者的动脉粥样硬化斑块中及斑块破裂的好发部位“肩部”均有高表达。还有研究证明uPA与MMPs均受到EGF/EGFR系统的调控,uPA可通过诱导MMPs的表达起到水解ECM的作用。那么,在人动脉粥样硬化病变过程中,EMMRPIN、uPA两者存在什么样的关系,uPA是否也通过MMPs这一途径致动脉粥样硬化并起到粥样斑块去稳定的作用,抑或EMMRPIN通过调节uPA表达的作用参与到动脉粥样硬化斑块的发生发展中。 多项大型临床试验证实应用他汀类药物可明显减少稳定性心绞痛及ACS患者的心血管病死亡率及全因死亡率,且不全依赖于血浆胆固醇的降低,但其中的相关机制目前尚不完全清楚。阿托伐他汀(atorvastatin)是羟甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂,作为代表性的他汀类药物,除具有调脂作用外,亦被认为具有抑制炎症反应、抗氧化应激、稳定内皮功能、稳定斑块、促进凋亡、抑制平滑肌细胞的增生、抑制血小板的凝集等不依赖于胆固醇降低的直接和间接心血管保护作用。WOSCOPS(西苏格兰冠心病预防研究)、AFCAPS/TexCAPS试验(空军/得克萨斯州冠状动脉粥样硬化研究)、ASCOT LLA、4S(北欧辛伐他汀生存研究)、CARE(冠心病事件复发研究)、LIPID(普伐他汀对冠心病的长期干预)等大型国际临床实验结果均证明他汀类药物的使用可使致命性和非致命性心肌梗死发病率降低,心血管事件减少,总病死率降低,血管重建/CABG需求减少。 本实验以所形成病变与人类动脉粥样硬化病理学形态极为相似的载脂蛋白E基因敲除小鼠高脂饮食饲养建立动脉粥样硬化模型,在体探讨EMMPRIN与uPA在动脉粥样硬化斑块中表达情况及阿托伐他汀干预对其表达的调节作用:1、EMMPRIN与uPA是否在动脉粥样硬化斑块中共同高表达;2、EMMPRIN与uPA的表达是否与斑块的不稳定性相关,在不同的阶段的斑块中表达是否存在区别;3、阿托伐他汀的应用是否对EMMPRIN与uPA的表达存在影响,与时间及剂量是否相关。从而为动脉粥样硬化病变及ACS的发生发展机制研究提供理论依据。 实验方法 1、8周龄雄性ApoE-/-小鼠62只,平均体重24g,普通饲料适应性喂养1周后,随机抽出6只用作备用,按照普通小鼠饲料+15%猪油+1.25%胆固醇比例配制高脂饮食饲料,余下56只鼠随机分为早期干预(ES)组(n=28)及晚期干预(LS)组(n=28)分别饲养6周及10周建立动脉粥样硬化模型。随后均使用阿托伐他汀药物干预,早晚干预组各随机分为4组(n=7),分别为普通饮食对照组(A,E),高脂饮食对照组(B,F),低剂量干预组(5mg/kg.d)(C,G),高剂量干预组(10mg/kg.d)(D,H);干预组用高低两种剂量阿托伐他汀混悬液0.3ml/d灌胃,对照组用等量生理盐水灌胃。药物干预8周后处死小鼠,采集标本。 2、血脂检测:ApoE-/-小鼠处死前取血清,Olympus Au2700全自动生化分析仪检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平。 3、苏木精-伊红染色:取ApoE-/-小鼠主动脉制备石蜡切片,脱蜡后用苏木精-伊红(HE)染色,观察主动脉根部动脉粥样硬化斑块形态。 4、半定量RT-PCR:取ApoE-/-小鼠主动脉,液氮中研磨组织,RNAiso Plus提取总RNA,核酸蛋白分析仪测定RNA浓度,两步法逆转录试剂盒转录为cDNA。所有引物均参照Gengbank提供的序列,由大连宝生物公司合成。基因EMMPRIN和uPA、β-actin进行PCR扩增的引物序列分别是:EMMPRIN:上游:5’-GCA GAG GAC ACA GGC ACT TAC-3’,下游:5’-ACA GGC TCA GGA AGG AAG ATG-3’;uPA:上游:5’-CCC CAA GGT TTACTG ATG TGC TC-3’,下游:5’-GAA GTG TGA GAC CCT CGT GTA GA--3’;β-actin:上游:5’-AGA TTA CTG CTC TGG CTC CTA GC-3’,下游:5’-ACT CAT CGT ACT CCTGCT TGC T-3’。RT-PCR仪扩增目的基因后用1.5%琼脂糖凝胶电泳,凝胶成像仪分析其图像并测得灰度值,以EMMPRIN和uPA与β-actin光密度比值表示EMMPRIN与uPAmRNA的表达水平。 5、实时定量RT-PCR:总RNA提取、cDNA合成同前,基因表达用SYBR Green1荧光定量PCR进行分析。 6、蛋白提取和Western blot:取ApoE-/-小鼠主动脉,液氮中研磨后按1mg组织加入预冷的10ul裂解液(含终浓度为1mM的PMSF)裂解组织,收集裂解的组织在4℃下,20000转离心30min,使用BCA定量试剂盒检测蛋白浓度。取40μg总蛋白样品与上样缓冲液,混匀后100℃煮5min,在10%SDS-PAGE中行垂直电泳(80-100V,120min),室温50V×120min转样品至PVDF膜,6.0%脱脂奶粉在4℃下温和振荡封闭过夜。取出膜结合相应的EMMPRIN和uPA抗体,浓度按说明书配比;内参anti-GAPDH,浓度为1:1000,室温振荡1h,4℃孵育过夜,TBST洗膜后,结合相应的辣根过氧化物酶标二抗,浓度为1:2500),室温1h。用化学发光试剂(ECL)盒与PVDF膜共孵育1min后,将PVDF膜与X光片放入暗盒内曝光3min,显影后定影。扫描胶片,用软件分析条带光密度值,以EMMPRIN和uPA与GAPDH条带的吸光面积积分比值评定EMMPRIN与uPA蛋白表达水平。 7.免疫组化及胶原细胞的检测:免疫组化法使用抗体检测巨噬细胞、平滑肌细胞。步骤如下:切片脱蜡至水,0.3%H2O2甲醇处理切片,蒸馏水、PBS清洗。枸橼酸盐缓冲液微波抗原修复,取出迅速冷却,PBS清洗洗。封闭后加入对应一抗孵育。清洗后二抗孵育。PBS洗,蒸馏水洗。Harris苏木素染核。蒸馏水洗,分化,蓝化,脱水,透明并封固。于光镜下观察染色结果,结果用Image Pro Plus6.0分析软件分析。Masson法检测胶原成分,步骤为:切片脱蜡至水,0.3%H2O2甲醇处理切片,蒸馏水、PBS漂洗。Harris苏木素染核,盐酸酒精分化。蒸馏水冲洗,丽春红酸性品红液染色,蒸馏水冲洗。1%磷钼酸中染色,不洗,置于苯胺蓝液或亮绿液。蒸馏水快速冲洗,60℃温箱烘干,二甲苯透明,封固。于光镜下观察染色结果,结果用Image Pro Plus6.0分析软件分析。 结果 1、成功建立动脉粥样硬化动物模型:ApoE-/-小鼠在高脂饮食(普通小鼠饲料+15%猪油+1.25%胆固醇)6周后,主动脉大体标本石蜡切片HE染色倒置相差纤维镜下观察小鼠主动脉内AS斑块形成。至10周,可见形成粥样核心及纤维帽的显著斑块,斑块内大量泡沫细胞形成和堆积,主动脉内膜增厚,向管腔突出,模型建立成功。 2、ApoE-/-小鼠主动脉石蜡切片HE染色倒置相差纤维镜下观察结果显示,小鼠高脂饮食饲养6周时相比普通饮食喂养小鼠所形成斑块内泡沫细胞形成和堆积明显增多,主动脉内膜明显增厚,并突向管腔,斑块稳定性差,较易损。随高脂饮食喂养时间延长,粥样斑块病变程度加重,斑块不稳定性增强,与普通饮食喂养小鼠相比存在明显差异,斑块的形成早期且程度严重。 3、ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块内EMMPRIN与uPA基因及蛋白的表达:早/晚干预组高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉分别用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫组化方法从基因、蛋白及组织三个水平检测EMMRPIN、uPA的表达。结果显示高脂饮食喂养的小鼠EMMPRIN与uPA的基因及蛋白的表达与普通喂养对照组相比明显增加,差别均有统计学意义(P0.05,基因及蛋白的表达都做了内对照)。 4、阿托伐他汀干预可降低ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中EMMPRIN与uPA的表达:对使用高脂饮食建立了动脉粥样硬化模型的小鼠,使用不同剂量的阿托伐他汀进行干预,并分别用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫组化法检测小鼠主动脉及粥样硬化斑块内EMMPRIN与uPA的基因、蛋白及组织水平的表达;结果显示,阿托伐他汀干预后主动脉内EMMPRIN与uPA的表达与高脂组相比显著降低,差别均有统计学意义(P0.05)。高脂饮食喂养的ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中EMMPRIN与uPA表达上调,该现象可被阿托伐他汀所阻断。 5、阿托伐他汀通过剂量依赖降低ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中EMMPRIN与uPA表达:分别使用高/低两种剂量阿托伐他汀干预使用高脂饮食喂养建立动脉粥样硬化模型的小鼠,并分别用RT-PCR、Real-Time PCR及Western blot、免疫组化法检测小鼠主动脉及粥样硬化斑块内EMMPRIN和uPA基因及蛋白的表达;结果显示,高剂量组主动脉内EMMPRIN与uPA的基因及蛋白的表达与低剂量组相比显著降低,差别均有统计学意义(P0.05)。ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中EMMPRIN与uPA的表达上调可被阿托伐他汀所剂量依赖型阻断。 6.uPA与EMMPRIN在ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中表达增高且呈相同趋势,使用阿托伐他汀干预后均出现表达的明显下降且趋势一致。 结论 1.高脂饮食可诱导ApoE-/-小鼠主动脉内早期形成程度严重的粥样硬化斑块; 2.ApoE-/-小鼠主动脉、动脉粥样硬化斑块中EMMPRIN与uPA出现过表达,其程度与斑块的严重程度及不稳定性相关。 3.他汀可一定程度减轻高脂喂养的ApoE-/-小鼠主动脉粥样硬化斑块病变严重程度。 4.他汀干预的高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠主动脉、动脉粥样硬化斑块中,EMMPRIN与uPA的过表达程度减轻,且该作用中存在着剂量依赖关系。 5.uPA与EMMPRIN在ApoE-/-小鼠主动脉及粥样硬化斑块中存在时间与组织共定位关系。


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