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《第三军医大学》 2013年
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白藜芦醇在血管内皮细胞的生物利用特点和抗炎机制研究

陈明亮  
【摘要】:心脑血管疾病已经成为人类死亡的首要原因,动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病的主要病理基础,不健康的生活方式特别是不合理的膳食结构与AS发生密切相关。AS是一个多因素、多阶段的病理过程,发病机制复杂,至今尚未完全阐明。目前较公认AS为一种慢性炎症性疾病,炎症反应贯穿于AS发生发展的各个阶段,而始于内皮细胞的炎性损伤。因此,减轻血管内皮细胞炎性损伤已经成为防治AS的重要途径。大量研究发现植物性食物摄入与多种慢性代谢性疾病的发生呈负相关,而其健康效应的功效成分主要是植物化学物(phytochemicals)。植物化学物种类繁多,包括多酚、胡萝卜素、皂甙、含硫化合物等,其中研究最多的是多酚类。白藜芦醇(resveratrol,RSV)是多酚中一类重要的化合物,流行病学调查发现膳食RSV的摄入与心血管疾病的发生显著负相关。然而,RSV抗AS作用的相关机制尚未完全阐明。一方面,体内代谢和生物利用的研究发现,RSV虽然具有较高的肠道吸收率,然而其体内清除速率快、半衰期短,导致其生物利用率很低,这与RSV显著的心血管保护效应形成了明显的反差,除非存在潜在的血管内皮或血管壁组织的有效摄取利用和组织靶向分布。另一方面,近年来研究发现,细胞自噬在调控内皮细胞炎性损伤中起关键作用,RSV是否能够通过诱导细胞自噬抑制内皮细胞炎性反应,以及RSV在细胞内确切的作用靶点和作用机制,还有待进一步研究。 本课题利用原代培养的人脐静脉内皮细胞,首先利用RSV的自发荧光特性,采用荧光分光光度计、HPLC、LC-MS、激光共聚焦、RNAi等方法明确RSV是否能被内皮细胞摄取利用,并分析时间、浓度、温度依赖的摄取利用特点,进而探索血清蛋白和SGLT1受体在RSV跨内皮细胞膜转运中的作用。在此基础上,围绕血管内皮细胞炎症反应这一AS发生发展的重要诱因,建立TNF-a诱导的内皮细胞炎症损伤模型,利用多种抑制剂、激动剂、RNAi、质粒转染、电镜、共聚焦、Westenr blot等技术,观察RSV对内皮细胞自噬的影响,并进一步明确RSV对cAMP-PKA-AMPK-SIRTl信号通路的影响,深入揭示RSV抑制内皮炎症反应的作用机制。 本实验的主要实验结果和结论如下: (1) RSV能够被内皮细胞摄取利用,主要分布于细胞浆,并在大鼠动脉壁存在持久分布特征。 (2) RSV能够通过被动扩散和主动转运两种方式进入血管内皮细胞;被动转运受到血清蛋白尤其是白蛋白的影响,而主动转运依赖于SGLT1受体。 (3) RSV能明显抑制TNF-a诱导的内皮细胞炎性反应,主要表现为抑制内皮细胞炎症因子的释放和炎性介质的表达。 (4)自噬在RSV抑制TNF-a诱导的内皮细胞炎性反应中发挥重要作用。RSV能以剂量和时间依赖方式增加内皮细胞的自噬水平,自噬被抑制后,RSV的抗炎作用被显著削弱。 (5) SIRT1相关信号通路在RSV诱导内皮细胞自噬中发挥重要作用。RSV能够增加内皮细胞cAMP的含量,从而促进PKA表达,激活AMPK,进而增加SIRT1表达;而抑制AC、PKA、AMPK、SIRT1活性或采用RNAi沉默JC、PKA, AMPK, SIRT1基因表达后,RSV诱导的内皮细胞自噬被显著抑制。结果表明,cAMP-PKA-AMPK-SIRTl信号通路在介导RSV促进内皮细胞自噬中发挥重要作用。 综上所述,RSV能够被血管内皮细胞有效摄取及存在血管壁持久分布,并通过活化SIRT1/自噬相关信号通路抑制内皮细胞炎性损伤。 植物化学物的健康促进作用的研究已经成为营养学领域研究的热点,同时也是药物研发先导化合物的重要来源。本研究结果对于深入认识RSV的心血管保护作用机制及研发更有效的AS防治药物提供了重要实验证据。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R285

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