联合基因转染大鼠脂肪来源干细胞构建组织工程骨的实验研究

【摘要】：背景： 骨缺损的修复一直是骨科临床亟待解决的难题之一。近年来，随着组织工程的空前发展，应用组织工程化骨修复骨缺损成为了研究热点。骨的再生是一个多因素相互作用的复杂过程，这一过程中，许多生长因子发挥着重要的调控作用，其中骨形态发生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）与成骨诱导有着密切的关系。BMP家族成员中，BMP2具有最高的成骨诱导活性，同时，研究表明，BMP7可以促进成骨细胞增殖和新骨形成。因此，我们推测共表达BMP2和BMP7可能更有利于ADSCs细胞向成骨细胞转化以及转化后细胞的增殖，从而在体内更好地促进骨组织的生长和愈合。 目的： 以人工合成β-TCP钙磷陶瓷为支架材料，复合BMP2与BMP7联合基因修饰的大鼠脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)，研究构建组织工程骨的可行性。 方法： (1)大鼠的脂肪来源干细胞（ADSCs）的分离培养、体外扩增，以及细胞表面标志和分化潜能检测。 (2)分别构建携带绿色荧光蛋白(GFP)的BMP2重组慢病毒表达质粒及携带红色荧光蛋白(RFP)的BMP7的重组慢病毒表达质粒。以Lv-BMP2转染ADSCs、Lv-BMP7转染ADSCs和Lv-BMP2、Lv-BMP7共转染ADSCs，另设未转染ADSCs作为对照。并以Realtime PCR和Western blot检测转染后细胞中BMP2和BMP7基因的mRNA和蛋白表达情况。应用Western blot检测转染后14天各组细胞骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原的蛋白表达情况，并检测各组碱性磷酸酶(ALP)的活性。 (3)体外培养BMP2与BMP7联合基因修饰的ADSCs，并种植于β-TCP，进行体外复合培养。使用Picogreen染料定量细胞中的双链DNA，监测细胞增殖过程。采用ALP定量检测细胞在材料内表达ALP的情况。并通过茜素红染色、荧光定量PCR检测细胞与支架材料复合物的成骨活性。 (4)建立大鼠股骨缺损模型，按分组将细胞与支架材料复合物回植于股骨缺损处，回植后2、4、6周时X光拍照，同时组织学观察体内成骨情况。 结果： (1)分离的大鼠ADSCs在体外具有很强的增殖能力，表面抗原CD44、CD29表达呈阳性，CD45、CD34、CD11b表达呈阴性，并具有向成骨和成脂细胞分化潜能。 (2)慢病毒转染后细胞中BMP2和BMP7基因可以高效稳定表达。骨钙素(OCN)和Ⅰ型胶原的表达明显升高，并且联合转染组最高。联合转染组的ALP活性也明显高于单转组。 (3) ADSCs经BMP基因修饰后，双链DNA定量分析发现各组细胞在支架材料上生长增殖良好。细胞接种到支架材料14天后，双基因修饰组的ALP活性、钙化以及ALP、OPN、OC基因表达均明显高于单基因修饰组。 (4)裸鼠实验中，X光和组织学检测显示，BMP2和BMP7双基因修饰组及单基因修饰组都有新骨形成，但双基因修饰组的成骨面积多于单基因修饰组(P0.01)。 结论： 通过慢病毒载体系统进行双基因转染的大鼠脂肪干细胞（ADSCs）复合支架材料β-TCP体外构建组织工程骨及体内成骨的实验研究，我们证实利用慢病毒载体系统可以实现ADSCs稳定长期共表达hBMP2及hBMP7基因。此外，BMP2和BMP7双基因共表达比单基因表达能够更有效促进组织工程化骨的成骨效果。

【关键词】：骨组织工程 脂肪来源干细胞 骨形态发生蛋白 慢病毒 β-磷酸三钙
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R318.08
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