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《第三军医大学》 2015年
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miRNA-155介导ESAT-6诱导巨噬细胞凋亡的分子机制及其在结核诊断中的作用

杨绍俊  
【摘要】:研究背景:结核感染仍是世界公共卫生难题,据2014年世界卫生组织(World Health Organization,WHO)统计:2013年约有900万新增活动型结核病人,其中高达150万人因结核病而丧命。近年来随着多重耐药结核、广泛性耐药结核病的出现以及HIV-TB的合并感染,更加剧了目前结核病防控的严峻形势。结核病的主要致病菌为结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb),其主要潜伏感染人巨噬细胞,并引起宿主细胞坏死裂解。抗结核免疫应答是机体清除结核分枝杆菌的重要环节。除作为Mtb的主要感染细胞,巨噬细胞同样也是机体杀死结核分枝杆菌的重要效应细胞。已有研究表明:细胞凋亡在机体抗结核固有免疫应答中发挥重要作用,Mtb减毒株或无毒株可促进细胞凋亡发生,控制结核感染;然而Mtb强毒株可抑制凋亡并诱导细胞坏死,引起结核扩散。结核早期分泌抗原ESAT-6,作为结核分枝杆菌的重要毒力因子,在免疫调节中亦发挥重要作用。已有研究显示:结核早期分泌抗原ESAT-6能够促进巨噬细胞凋亡,有利于机体清除结核分枝杆菌,但其相关分子机制并不十分清楚。在前期预实验中,我们发现:ESAT-6抗原刺激巨噬细胞后,能引起胞内mi R-155表达显著升高,相关研究报道mi R-155参与了卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)介导的巨噬细胞凋亡,通过生物信息学预测分析,我们发现细胞信号抑制分子-1(suppressor of cytokine signaling-1,SOCS1)是mi R-155的一个重要靶基因,且已有证据表明SOCS1可能是Mtb感染时巨噬细胞中调节细胞因子信号通路的一个关键分子,由此,我们推测mi R-155与SOCS1相互作用可能参与了结核早期分泌抗原ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡过程。本研究拟在已有研究报道和我们前期工作基础上开展如下工作:(1)明确结核抗原ESAT6处理巨噬细胞后,巨噬细胞内mi R-155、SOCS1的动态变化和时间特异性;(2)应用慢病毒转染控制mi R-155及SOCS1表达,探讨ESAT-6处理后,巨噬细胞中凋亡分子Caspase-3表达情况,明确mi R-155及SOCS1在巨噬细胞凋亡中的作用;同时采用si RNA干扰技术控制Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)及NF-κB p65表达,初步探讨ESAT-6诱导mi R-155表达上调的原因;(3)收集人外周血单个核细胞,荧光定量PCR检测特定免疫分子及细胞因子表达情况,探讨其在结核诊断中的作用。本研究力图为阐明ESAT-6在宿主免疫调节中的作用提供新的理论依据,同时亦为寻找新的结核病干预靶点及临床结核病诊治提供新的思路。方法:1.应用结核早期分泌抗原ESAT-6处理巨噬细胞系RAW264.7,收集经处理后不同时间点细胞总RNA及蛋白,实时荧光定量PCR技术检测胞内mi R-155、BIC、SOCS1、IL6及TNF-α及IFN-γ等m RNA表达水平;Western-blot技术检测SOCS1、NF-κB p65及凋亡分子Caspase-3蛋白表达水平;同时,采用流式细胞仪检测不同时间点细胞凋亡发生情况;2.采用慢病毒过表达mi R-155及抑制mi R-155,实时荧光定量PCR技术检测胞内SOCS1、IL6及TNF-αm RNA表达变化;Western-blot技术检测SOCS1及凋亡分子Caspase-3蛋白表达水平变化;并用流式细胞仪分析抑制mi R-155后对细胞凋亡的影响;3.采用慢病毒过表达SOCS1基因,Western-blot技术检测凋亡分子Caspase-3蛋白表达水平;同时在过表达SOCS1的条件下,Western-blot技术及流式细胞术观察mi R-155对巨噬细胞凋亡的影响;4.为了进一步弄清楚ESAT-6诱导mi R-155表达上调的主要原因,我们采用了si RNA干扰技术,控制RAW264.7细胞内TLR2及NF-κB p65的表达,并用Western-blot技术观察TLR2及NF-κB p65干扰效果,以及实时荧光定量PCR技术检测细胞内mi R-155表达水平;5.将研究人群分为三个组:正常对照组、活动型结核组及潜伏型结核组。收集人外周血单个核细胞,提取总RNA,采用实时荧光定量PCR技术检测特定免疫分子(TLR2、BIC、mi R-155、SOCS1)及细胞因子(TNFα、IL6、IL12p40、i NOS、IFN-γ)m RNA表达水平。结果:1.ESAT-6处理巨噬细胞24h内,细胞凋亡分子活性Caspase-3表达不断增加;流式细胞检测结果亦表明ESAT-6能够显著促进巨噬细胞凋亡发生,并有时间依赖效应;此外,研究结果显示mi R-155、BIC及相关细胞因子m RNA表达水平随ESAT-6处理时间不断增加,而SOCS1表达水平随时间增加而不断下降;2.单独过表达mi R-155能显著抑制SOCS1表达,提高巨噬细胞凋亡分子Cleaved Caspase-3表达,并促进巨噬细胞凋亡发生。采用慢病毒抑制mi R-155表达,巨噬细胞内SOCS1表达明显升高,而细胞因子如IL6,TNF-α等表达显著减少,细胞凋亡受到明显抑制;3.过表达SOCS1基因可抑制ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡;而在过表达SOCS1条件下,过表达mi R-155则可恢复Cleaved Caspase-3表达及大部分巨噬细胞凋亡的发生。4.成功构建TLR2及NF-κB p65-si RNA干扰细胞系,结果发现抑制TLR2表达能显著降低ESAT-6介导的NF-κB p65表达,并干扰细胞内mi R-155的表达,提示TLR2/NF-κB活化可能是ESAT-6诱导mi R-155表达上调的主要原因。5.Q-PCR检测人外周血单个核细胞中特定免疫调节分子(TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1)和细胞因子结果表明:TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1在各组别中差异表达,进一步统计分析提示mi R-155/SOCS1比值可能区分活动型结核及潜伏型结核感染。结论:1.mi R-155在ESAT-6介导的巨噬细胞免疫活化及凋亡过程中具有重要作用;2.mi R-155可能通过靶向作用SOCS1参与调控结核早期分泌抗原ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡发生;3.ESAT-6诱导的mi R-155表达上调与巨噬细胞内TLR2/NF-κB活化相关;4.TLR2,BIC,mi R-155以及SOCS1或可作为结核病诊断的新型生物标记分子。综上所述,TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1信号参与了ESAT-6介导的巨噬细胞凋亡过程,mi R-155在ESAT-6介导的巨噬细胞免疫反应中发挥重要作用,这可能揭示了结核早期分泌抗原ESAT-6在宿主免疫调节作用中的新机制。同时,本研究提示TLR2/NF-κB/mi R-155/SOCS1或可作为宿主免疫调节治疗的重要靶标,为结核治疗研究增添了新的内容;此外,人群研究提示TLR2,BIC,mi R-155及SOCS1或可作为活动型结核及潜伏型结核诊断的重要指标,为结核病的诊断可能提供了新的思路。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R52

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