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《第三军医大学》 2015年
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基于酵母微囊构建新型口服巨噬细胞靶向递送系统的研究

周兴  
【摘要】:口服给药因其良好的安全性、便捷性与患者依从性是目前临床使用最为广泛的给药方式。近年来,随着纳米技术、材料学及药学等学科交叉研究的深入发展,现有的口服药物递送系统在肠道粘附释放、肠道局部靶向释放及肠道药物转运等方面已取得了诸多的进展,为大量难溶性药物提供了较为理想的口服载体系统。此外,有关新型靶向药物递送系统的大量研究已清楚地表明靶向释药在提高药物疗效的同时,可显著降低药物的非靶效应。与静脉系统靶向药物递送系统的高速发展相比,口服靶向药物递送系统的发展相对滞后。当前研究的口服靶向递送系统仍大多局限于以增加药物生物利用度为目的的消化道靶向(如肠道粘附系统、pH响应性结肠靶向递送系统等)或淋巴系统靶向。由于口服后吸收转运途径的复杂环境,迄今为止,针对胃肠道以外病灶部位的口服靶向药物递送系统仍鲜有文献报道。为实现药物的口服靶向递送,本课题首次创新性基于仿生学原理,通过模仿微生物经消化道系统性感染途径,利用酵母微囊(Yeast shell,YS)表面的β-1,3-D-葡聚糖构建了新型口服巨噬细胞靶向递送系统,并基于炎症及肿瘤部位的巨噬细胞募集作用成功实现了炎症及肿瘤部位的口服靶向成像与药物的靶向递送。方法1.酵母微囊的制备取一定量的酵母菌分别经NaOH溶液与HCl溶液处理后采用有机溶剂除去可溶组分,真空干燥后即得YS。2.正电荷纳米粒/酵母微囊系统的制备与表征称取一定量的YS,并加入pH 9.2的碳酸盐缓冲液,超声至均匀分散后于37℃孵育1 h,再加入正电荷量子点(聚二甲基二烯丙基氯化铵(PDDA)表面修饰的量子点,即PDDA-QD)或正电荷氧化铁纳米粒(PDDA修饰的氧化铁纳米粒,即PDDA-IONP),恒温孵育一定时间后,离心水洗,干燥后即得量子点/酵母微囊(QD YS)或氧化铁纳米粒/酵母微囊(IONP YS)。采用透射电镜(TEM)、激光共聚焦显微镜(CLSM)、表面电位粒度仪等仪器对其形貌及粒径大小进行表征,并采用荧光光谱仪(fls)与热重分析仪(tga)对酵母微囊内的量子点(qd)与氧化铁纳米粒的含量进行测定,计算其负载量与包封率。3.酵母微囊对巨噬细胞生物学活性的影响将小鼠源性巨噬细胞细胞株raw264.7与酵母微囊按细胞与微囊个数比1:50共孵育2h后,分别从巨噬细胞的吞噬与迁移两个方面研究酵母微囊对巨噬细胞生物学活性的影响。4.口服酵母微囊的初步安全性评价小鼠口服灌注酵母微囊混悬液,剂量为5g/kg,每天记录体重与基本状况;14天后测定小鼠的肝肾功、血脂及血常规指标的变化,并取其主要脏器计算其脏器指数;制备苏木精-伊红(he)染色切片,观察脏器的病理变化。5.巨噬细胞对酵母微囊的识别作用研究将raw264.7与酵母微囊按细胞与微囊个数比1:50共孵育0.5,1,2,4,6,8h后,用磷酸缓冲盐(pbs)清洗细胞3次,4%多聚甲醛固定10min,细胞核染料dapi染色后,用clsm与流式细胞术(fcm)进行定性与定量分析。采用dectin-1特异性抑制剂昆布多糖对巨噬细胞识别酵母微囊的机制进行研究。6.急性炎症靶向荧光成像的研究裸鼠足趾肿胀(即急性炎症模型)造模后,经灌胃给予生理盐水、pdda-qd或不同剂量的qdys,同时静脉注射聚乙二醇修饰的量子点作为阳性对照,通过活体成像观察不同时间点足趾肿胀部位的荧光强度及给药24h后主要脏器的荧光强度。最后,采用免疫荧光染色与fcm进一步对qd在足趾肿胀部位及脏器内的细胞分布进行研究。7.荷瘤小鼠体内肿瘤靶向荧光成像研究采用花青染料7.5(cy7.5)修饰的聚乙烯亚胺自组装,制备含近红外荧光探针cy7.5的正电荷纳米组装体(cy7.5-pei),并将其负载于ys中形成负载cy7.5的酵母微囊(cy7.5ys)。选择裸鼠接种人乳腺癌细胞mcf-7建立荷瘤小鼠模型,分别口服灌注生理盐水、cy7.5-pei溶液或cy7.5ys混悬液。通过活体成像观察不同时间点肿瘤部位的cy7.5荧光强度及给药48h后主要脏器的荧光强度。另外,将qdys连续口服给药3天,处死裸鼠,采用免疫荧光染色与fcm对肿瘤部位qd的细胞分布进行分析。8.ionpys在大鼠急性炎症模型中的磁共振成像应用sd大鼠足趾肿胀造模后,经灌胃给予生理盐水、pdda-ionp或不同剂量的ionpys,同时静脉注射聚乙二醇修饰的氧化铁纳米粒(peg-ionp)作为阳性对照,通过磁共振成像系统(mri)观察不同时间点足趾肿胀部位的t2强度。9.ionpys在肿瘤磁共振成像中的应用sd大鼠接种大鼠乳腺癌细胞walker256建立荷瘤大鼠模型,待肿瘤大小约为1cm3时,分别口服给予生理盐水或ionpys,并采用peg-ionp作为阳性对照,通过mri观察ionpys给药后不同时间点对应的肿瘤部位的t2强度。10.难溶性小分子药物-聚乙烯亚胺纳米组装体的制备与表征称取一定量的含羧基疏水小分子药物(cbd)与10mg枝化聚乙烯亚胺(bpei)共溶于1ml水溶性有机溶剂中,超声溶解后透析袋中透析24h,冷冻干燥后即得cbd/bpei纳米自组装体。另精密称取一定量的无羧基难溶性药物(ncbd)与cbd和分子量为25kda的bpei(bpei25)共溶于1mldmso中,同样采用上述透析法制备ncbd/bpei纳米自组装体。采用clsm和tem对纳米自组装体的形貌进行表征,并测定其zeta电位与粒径。采用紫外分光光度法(uv)测定组装体中cbd的含量,高效液相色谱法(hplc)测定组装体中ncbd的含量。将纳米组装体置于pbs、胰蛋白酶溶液和糜蛋白酶溶液观察纳米组装体的体外稳定性情况。采用分子模拟、红外吸收光谱(ft-ir)、核磁共振光谱(nmr)、差示扫描量热仪(dsc)等对bpei25与cbd之间的非共价键作用力进行模拟与表征。11.纳米自组装体的体外抗肿瘤活性将小鼠源性黑色素瘤细胞b16f10、人源性肝癌细胞hepg2,人源性宫颈癌细胞hela,mcf-7和人源性乳腺癌细胞mda-mb-231等肿瘤细胞株与不同剂量的负载有吲哚美辛(indomethacin,ind)的正电荷纳米组装体(ind/bpei25)或负载有紫杉醇(paclitaxel,ptx)的正电荷纳米粒组装体(ptx/ind/bpei25)或ptx(ptx溶于1:1的cremophorel#174;和乙醇混合溶剂中)共孵育24或48h,然后采用mtt法测定细胞存活率,originpro7.0计算ic50值。12.载药酵母微囊的制备与表征称取一定量的ys,加入适量去离子水,超声至均匀分散后于37℃孵育1h。随后,按药物与ys质量比10:1的比例加入正电荷纳米组装体溶液,分散均匀后恒温孵育一定时间至上清液澄清后,离心水洗,干燥后即得载药酵母微囊。采用clsm与tem载药酵母微囊的形貌进行表征,并测定其载药量与包封率。13.体外释放实验分别称取一定量的待测样品在ph7.4的pbs缓冲液及模拟胃肠道环境下进行药物释放实验。其中,cbd与ncbd的浓度分别采用uv和hplc测定,并计算药物的累积释放百分率,绘制药物累积释放曲线。14.体内药动学实验sd大鼠经口服灌胃给药后按设定时间点收集血样,3000rpm离心10min取血浆,提取和测定各时间点血浆中药物浓度,并采用das3.0软件计算其药动学参数。15.体内药物分布实验sd大鼠经口服灌胃给药后不同时间点经颈椎脱臼处死,分离主要脏器及组织,随后进一步采用梯度离心法分离肝、脾、肠系膜淋巴结及足趾肿胀部位的单核/巨噬细胞,采用hplc测定各脏器、组织及单核/巨噬细胞内的药物浓度。16.载药酵母微囊的体内抗炎疗效评价通过角叉菜胶诱导的急性足趾肿胀模型和弗氏佐剂介导的慢性关节炎模型来评价载药酵母微囊在抗炎药物靶向治疗中的应用;实验结束后收集足趾肿胀部位、胃肠道组织,进行病理切片及he染色分析,观察胃肠道刺激及足趾部位的炎症程度。17.酵母微囊的体内抗肿瘤活性评价b16f10细胞经裸鼠右后背部皮下接种,待肿瘤体积大小约10mm3时,经口服给予不同的ptx制剂,评价其体内抗肿瘤活性;小鼠处死后取其心、肝、脾、肺、肾,计算其脏器指数,测定肝肾功指标和血脂水平的变化。18.酵母微囊的肠道转运途径研究大鼠经口服或经肠注射qdys后,采用活体成像、体视荧光显微镜、clsm、免疫荧光染色及fcm等方法对回肠的肠上皮部位、小肠集合淋巴滤泡及肠系膜淋巴结中qdys的分布进行表征分析,以评价qdys在肠道的主要吸收部位及细胞转运机制。结果1.基于酵母菌酸碱处理成功获得了外壁主要由β-1,3-d-葡聚糖构成的酵母微囊,其zeta电位为-6.5mv左右,粒径约为4.5μm。并发现正电荷纳米粒可基于与酵母微囊之间的静电作用,首先富集于酵母微囊表面,随后进入酵母微囊内部形成qdys、ionpys等正电荷纳米粒/酵母微囊系统。2.酵母微囊在5g/kg口服剂量下对小鼠并未表现出明显的毒副作用或造成明显的病理变化。3.酵母微囊可基于dectin-1受体被巨噬细胞快速识别并吞噬,其在巨噬细胞内具有较高的稳定性,可在巨噬细胞吞噬后7天保持较为完整的酵母微囊形态。4.qdys经口服给药后可靶向分布至足趾肿胀部位或裸鼠肿瘤部位,能够显著提高足趾肿胀及肿瘤部位的荧光强度,具有良好的口服炎症及肿瘤靶向性荧光成像效果。脏器及细胞水平的研究表明,qdys在肝脾中具有较高的分布,其在肝、脾、足趾肿胀部位及肿瘤部位均特异性地分布于单核/巨噬细胞中。5.ionpys可口服靶向分布于足趾肿胀及肿瘤部位,ys负载提高了氧化铁纳米粒的t2弛豫作用,其效果与具有被动靶向效应的peg-ionp无显著性差异。6.基于含羧基疏水小分子药物与bpei之间的多重非共价键作用力可成功制备粒径大小在几十纳米至几百纳米之间,具有高效载药性能与广泛药物适用性的正电荷纳米组装体。7.正电荷纳米组装体表现出良好的体外生物学效应。ptx/ind/bpei25正电荷纳米组装体可提高肿瘤细胞对ptx的摄取,显著增强其体外抗肿瘤活性,具有明显降低的ic50值,对于多药耐药细胞株有更为明显的优势。8.通过酵母微囊与正电荷纳米组装体间的静电作用,可成功构建酵母微囊载药系统,如含ind的酵母微囊(indys)和含ptx的酵母微囊(ptxys)等。该酵母微囊载药系统可被巨噬细胞快速吞噬。9.体外药物释放研究表明酵母微囊载药系统可显著提高难溶性药物的体外释放速率;体内药动学评价证明酵母微囊载药系统能够明显增加ind的生物利用度,其药时曲线下面积(auc)为ind原料药的4.5倍。10.载药酵母微囊的体内组织与细胞水平的药物分布实验发现indys口服后可显著提高ind在机体单核/巨噬细胞中的分布,并依靠足趾肿胀部位巨噬细胞的募集作用,在该组织表现出靶向性的ind药物分布特征。11.indys在角叉菜胶介导的急性足趾肿胀模型与弗氏佐剂介导的慢性关节炎模型中具有比对应ind/bpei25纳米组装体更优异的抗炎能力,并能明显减轻ind对胃肠道的刺激。12.基于b16f10荷瘤小鼠进行的口服抗肿瘤活性评价表明,ptxys口服给药后有明显的肿瘤靶向效应,连续给药2周后其在肿瘤部位的ptx浓度可达到ptx注射液的7.8倍,并表现出优异的肿瘤抑制作用。13.通过活体成像、体视荧光显微镜及clsm进行的酵母微囊口服吸收途径的研究发现,qdys主要粘附与吸收部位为回肠段的集合淋巴滤泡,进一步的免疫荧光染色表明qdys在集合淋巴滤泡主要分布于m细胞与固有层的单核/巨噬细胞中。14.脾切除可显著减少QD YS在足趾肿胀部位及单核/巨噬细胞中的分布。此外,健康小鼠在口服QD YS后,QD在脾脏巨噬细胞的分布与足趾肿胀小鼠相似,但在肝脏巨噬细胞、外周血单核细胞及足趾巨噬细胞中的分布却显著下降。15.口服及静脉注射昆布多糖均可显著抑制QD YS在足趾肿胀部位及单核/巨噬细胞中的分布。口服昆布多糖可抑制肠道集合淋巴滤泡对QD YS的吸收。结论1.成功制备了外壁主要由β-1,3-D-葡聚糖构成的酵母微囊,基于静电作用,可将表面正电荷纳米粒或纳米组装体高效负载于其中;通过Dectin-1受体,酵母微囊负载系统可被巨噬细胞特异性识别并吞噬。2.酵母微囊经口服后可靶向递送至肿瘤及炎症部位的单核/巨噬细胞,通过炎症及肿瘤部位的单核/巨噬细胞募集作用,实现炎症与肿瘤部位的靶向成像,在细胞介导的靶向成像中具有良好的应用前景。3.通过含羧基疏水小分子药物与聚乙烯亚胺之间的多重非共价键作用力可成功构建载有难溶性药物的正电荷纳米组装体;该类正电荷纳米组装体可自发沉积于酵母微囊内,获得具有较高载药性能的酵母微囊载药系统。4.通过炎症及肿瘤部位的单核/巨噬细胞募集作用,酵母微囊载药系统可实现炎症与肿瘤部位的靶向药物递送,从而提高所负载药物的体内抗炎与抗肿瘤活性。5.酵母微囊口服后吸收的主要途径为经肠道集合淋巴滤泡M细胞表面的Dectin-1受体识别进入肠壁固有层,被其中的单核/巨噬细胞摄取并迁移至肠系膜淋巴结内,随后分布至淋巴循环内,在最大的淋巴组织脾脏中广泛分布于其单核/巨噬细胞中,并通过脾脏在炎症状态下对炎症部位单核/巨噬细胞的补充与迁移,最终将酵母微囊转运至外周血、脏器及炎症部位单核/巨噬细胞中。总之,本课题基于对微生物经胃肠道感染途径的认识,通过仿生学原理设计并构建了酵母微囊口服巨噬细胞靶向递送系统,并可基于炎症及肿瘤部位的巨噬细胞募集作用,实现炎症及肿瘤部位的靶向成像与药物的靶向递送。该载药系统制备方法简单高效,适用药物广泛,易于规模化制备,因此具有良好的应用前景。此外,该系统有望为口服炎症及肿瘤靶向药物递送的研究提供一种新的思路,并为其他巨噬细胞相关疾病的靶向治疗提供有效的递送策略。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R943

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