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PTSD状态下HCN2在脊髓和大脑调控内脏高敏感-中枢敏化的作用及机制

纪雷  
【摘要】:背景:创伤后应激障碍(Posttraumatic stress disorder,PTSD)是指人们遭受严重的打击后长期和延迟出现的精神心理障碍,可以引起机体发生病理生理改变,诱导内脏敏感性的形成,但其机制尚不清楚。近年来,PTSD关联疾病的发生率呈上升趋势,患病率及自杀率均较高,且尚无有效的防治措施,严重影响病人的正常生活。目前,国内外有关PTSD的研究才刚刚起步,尚不明确其作用的具体机制及有效的干预措施。如果能发现PTSD相关联疾病作用的具体机制、防止内脏敏感性的形成及发展,则可望为临床上防治PTSD相关联疾病提供新的治疗方法。超极化激活环核苷酸门控通道2(hyperpolarizaion-activated cyclic nucleotide-gated channels,HCN2),广泛分布于大脑和脊髓与内脏痛觉调制相关区域。有研究表明,在一些疼痛大鼠模型中,HCN2在脊髓和大脑中均大量表达,而应用HCN2的阻断剂ZD7288阻断Ih电流可明显减轻大鼠的疼痛症状。因此我们猜测HCN2通道在PTSD状态下内脏高敏感-中枢敏化的形成中亦发挥了重要作用,可能成为防止或抑制PTSD的新的靶点之一。NR2B亦在脊髓和海马中广泛表达。在脊髓背角神经元共培养模型中发现,突触前神经元的HCN2通道激活后可引起谷氨酸的释放,诱发脊髓背角NR2B介导的突触可塑性变化,导致NR2B发生酪氨酸磷酸化,参与痛觉及其中枢敏化形成。在疼痛模型研究中亦已证实,HCN2通道及其Ih电流、NR2B参与了疼痛及其痛觉敏化的调控作用。因此,我们推测,在脊髓和海马水平HCN2、NR2B共同参与了PTSD状态下内脏敏感性—中枢痛觉敏化的形成。本文拟采用免疫荧光技术、激光共聚焦技术及内脏敏感性的测定等方法阐明HCN2通道、NR2B共同参与PTSD状态下内脏敏感性—中枢敏化形成的机制,及CTX通过下调HCN2的表达发挥抗内脏伤害性效应,为临床上防治PTSD相关疾病提供新方法。性刺激效应目的:研究PTSD诱导的内脏敏感性的改变及HCN2阻断剂ZD7288的抗内脏伤害性刺激效应。方法:1)实验动物及分组:随机选取清洁成年SD(sprague-dawley rats,SD)雌性大鼠22只,体重约150~200g,将大鼠随机分为3组:即正常对照组(7只)、PTSD组(8只)和PTSD+ZD7288组(7只)。正常对照组:不予任何处理正常饲养;PTSD组:采用连续单一应激(single-prolonged stress model,SPS)联合电击刺激(1 m A,持续4 s)的方法制备PTSD内脏高敏感大鼠模型,术后7天进行实验;PTSD+ZD7288组:在建立PTSD大鼠模型的基础上,给予鞘内注射HCH2的阻断剂ZD7288(100 nmol/L),2h后开始实验。2)PTSD状态下内脏敏感性的检测:采用结直肠扩张(colorectal distention,CRD)引起内脏运动反射(visceromotor reflex,VMR)的方法检测大鼠内脏敏感性改变,并观察HCN2阻断剂ZD7288的抗内脏伤害性刺激效应。采用SPIKE2软件分析腹外斜肌的放电活动,即计算出肌电图(electromyogram,EMG)的平均曲线下面积(area under the curve,AUC),AUC值代表内脏敏感性的高低。结果:与正常组比较,在40mm Hg压力下行CRD时,PTSD组AUC明显高于正常对照组,差异有统计学意义(0.6200±0.0278 vs.0.3786±0.0155,P0.001);在60mm Hg压力下行CRD时,PTSD组AUC明显亦高于正常对照组(0.7663±0.0262 vs.0.5271±0.0212,P0.001)。在20、40、60mm Hg压力下行CRD时,PTSD+ZD7288组AUC较PTSD组显著降低,P值均有统计学差异(0.2180±0.0159 vs.0.2913±0.0229,P=0.005)、(0.4618±0.0157 vs.0.6200±0.0278,P0.001)、(0.6023±0.0173 vs.0.7663±0.0262,P0.001)。结论:采用SPS联合足底电击的方法可成功建立PTSD内脏高敏感大鼠模型,PTSD可诱导慢性的内脏高敏感性-中枢敏化状态的形成;鞘内注射HCN2的阻断剂ZD7288有明显的抗内脏伤害性刺激的效应。第一部分PTSD状态下内脏敏感性改变及HCN2阻断剂ZD7288的抗内脏伤害研究PTSD内脏高敏感状态下胸髓、腰髓和前额叶皮层、海马HCN2表达的改变。方法:1)实验动物及分组:选用清洁级成年雌性SD大鼠共14只,体重约150~200 g。将大鼠随机分为2组:即正常对照组和PTSD组,每组各7只。正常对照组无任何处理正常饲养;PTSD组,根据前述方法建立PTSD模型。2)采用免疫荧光及激光共聚焦技术研究HCN2在腰髓、胸髓和前额叶皮层、海马表达的改变。采用Image-Pro Plus6.0分析软件计算HCN2表达的平均光密度值(average optical density,AOD)值。结果:1)PTSD内脏高敏感状态下HCN2在腰髓水平的表达采用免疫荧光及激光共聚焦技术研究发现:在PTSD内脏高敏感模型组,HCN2集中分布于脊髓背角I-II层,在前角亦有少量表达,其HCN2表达的AOD值较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(121.12±4.85 vs.78.05±6.49,P0.001)。2)PTSD内脏高敏感状态下HCN2在胸髓水平的表达采用免疫荧光及激光共聚焦技术研究发现:在PTSD内脏高敏感模型组,HCN2亦主要分布于脊髓背角I-II层,在前角亦有少量表达,其HCN2表达的AOD值较正常对照组显著增加,差异有统计学意义(124.44±4.63 vs.70.13±5.46,P0.001)。3)PTSD内脏高敏感状态下HCN2在海马水平的表达采用免疫荧光及激光共聚焦技术研究发现:在PTSD内脏高敏感模型组,HCN2在海马神经元有大量表达,呈密集分布的深绿色荧光。与正常对照组比较,其HCN2的AOD值显著增加,差异有统计学意义(95.49±4.64 vs.65.36±4.34,P0.01)。4)PTSD内脏高敏感状态下HCN2在前额叶皮层的表达采用免疫荧光及激光共聚焦技术研究发现:在PTSD内脏高敏感模型组,HCN2在前额叶皮层有大量表达,其AOD值较正常对照组明显增加,差异有统计学意义(122.39±4.33 vs.96.28±5.78,P0.001)。结论:在PTSD状态下,在脊髓和大脑水平HCN2的表达明显上调。在中枢水平HCN2介导了PTSD内脏高敏感-中枢敏化形成的分子机制。第三部分PTSD状态下CTX通过影响HCN2的表达发挥抗内脏伤害性效应的作用及机制目的:第二部分在PTSD内脏高敏感状态下脊髓和大脑HCN2表达的改变目的:PTSD状态下β-内酰胺类抗生素头孢曲松钠(ceftriaxone,CTX)对脊髓HCN2表达的影响及CTX下调HCN2表达的抗伤害性效应。方法:1)实验动物及分组:选用清洁级成年雌性SD大鼠共44只,体重约150~200 g,将大鼠分为三组:正常对照组(14只,7只用于免疫荧光及激光共聚焦技术研究,另外7只用于内脏敏感性的测定);PTSD组(15只,7只用于免疫荧光及激光共聚焦技术研究,另外8只用于内脏敏感性的测定),PTSD+CTX组(15只,7只用于免疫荧光及激光共聚焦技术研究,另外8只用于内脏敏感性的测定)。正常对照组无任何处理正常饲养;PTSD组,根据前述方法建立PTSD模型;PTSD+CTX组在PTSD术后,连续7d给予CTX腹腔注射(200 mg/kg)。2)采用CRD-VMR检测大鼠内脏敏感性改变3)采用免疫荧光及激光共聚焦技术研究脊髓水平CTX对HCN2表达的影响。结果:与PTSD组比较,在20mm Hg压力下行CRD时,PTSD+CTX组AUC明显降低(0.2175±0.0090 vs.0.2913±0.0229,P=0.005);在40mm Hg压力下行CRD时,PTSD+CTX组AUC显著降低(0.5038±0.0336 vs.0.6200±0.0278,P=0.006);在60mm Hg压力下行CRD时,PTSD+CTX组AUC亦较PTSD组显著降低(0.6400±0.0245 vs.0.7663±0.0262,P=0.001)。免疫荧光结果显示:与PTSD组比较,在腰髓水平PTSD+CTX组HCN2表达明显减少,其AOD值显著降低(98.24±5.86 vs.121.12±4.85,P=0.012)。结论:在内脏高敏感状态下CTX可明显下调HCN2的表达,CTX可通过影响HCN2的表达发挥抗内脏伤害性作用。第四部分在PTSD状态下HCN2与NR2B在脊髓和海马共表达协同调控内脏高敏感性的机制目的:研究PTSD内脏高敏感状态下HCN2与NR2B在脊髓和海马的共同表达的改变。方法:1)实验动物及分组:选用清洁级成年雌性SD大鼠共13只,体重约150~200 g。将大鼠随机分为2组:即正常对照组(6只)和PTSD组(7只)。正常对照组无任何处理正常饲养;PTSD组,根据前述方法建立PTSD模型。2)采用免疫荧光及激光共聚焦技术研究HCN2与NR2B在脊髓和海马的共同表达的改变。采用Image-Pro Plus6.0分析软件计算HCN2表达的AOD值。结果:1)HCN2与NR2B在大鼠脊髓的共同表达观察比较HCN2、NR2B在对照组与PTSD组大鼠脊髓的共同表达,统计学分析结果表示,HCN2、NR2B在PTSD组大鼠脊髓表达的AOD值均明显高于对照组,差异有统计学意义(119.83±3.13 vs.79.33±3.52,P0.01)与(90.83±4.35 vs.64.83±3.40,P0.01)。2)HCN2与NR2B在大鼠海马的共同表达观察比较HCN2、NR2B在对照组与PTSD组大鼠海马的共同表达,统计学分析结果表示,HCN2、NR2B在PTSD组大鼠脊髓表达的AOD值均明显高于对照组,差异有统计学意义(96.17±3.47 vs.63.50±3.84,P0.01)与(114.17±3.52 vs.75.83±4.12,P0.01)。结论:在PTSD状态下,在脊髓和海马水平HCN2与NR2B的共同表达均明显上调。在中枢水平HCN2与NR2B共同调控了PTSD内脏高敏感-中枢敏化形成的分子机制。


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