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《第三军医大学》 2017年
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基于达沙替尼和全反式维甲酸的自组装共给药纳米系统抗肿瘤的研究

李欣  
【摘要】:黑色素瘤(Melanoma)是临床上较为常见的皮肤恶性肿瘤之一,其恶性程度较高、发展迅速、转移早而广泛,预后不良。近年来,黑色素瘤的发病率逐年升高,严重威胁着人类的健康。传统的化疗药物选择性低、毒性大,人体耐受性差。因此,开发新的具有高选择性、高效低毒的黑色素瘤靶向治疗药物显得尤为迫切。有研究发现酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinases,TPKs)在黑色素瘤中表达异常,这提示我们TPKs可能是一类新的黑色素瘤的治疗靶点。TPKs是控制细胞增殖、迁移和凋亡的重要蛋白质,其介导的信号转导与肿瘤的发生与发展密切相关。有研究表明50%以上的原癌基因和癌基因的产物都具有TPKs活性,TPKs异常表达会造成细胞增殖调节紊乱,进而诱导肿瘤发生。酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors,TKIs)以TPKs为靶点通过抑制细胞信号的转导而抑制肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭,并诱导肿瘤细胞的凋亡,并在一定程度上克服了传统的抗肿瘤药物选择性差、不良反应大等缺点,具有良好的应用前景。但肿瘤的发生和发展是一个复杂的、多因素的过程,抑制单一的信号传导不足以遏制肿瘤的进程,如不能解决肿瘤干细胞等引起的肿瘤复发、转移的问题。肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)即肿瘤内“增殖性干细胞”,是肿瘤发生、发展和转移的根源,具有自我更新、多向分化、高致瘤性和耐药性等特征。目前,对于恶性肿瘤的治疗主要采取手术切除、放疗和化疗。尽管这些治疗方法在很大程度上清除或杀灭了肿瘤组织和细胞,并延长了肿瘤患者的生存期,但是由于缺乏对CSCs的靶向性而无法真正解决肿瘤复发、转移和预后不良等问题,所以往往不能获得最佳的治疗效果。本文结合肿瘤细胞的信号传导和肿瘤干细胞的生理特征,以达沙替尼(Dasatinib,DAS)和全反式维甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)为模型药物,设计并制备基于DAS和ATRA的自组装共给药纳米系统,构建抑制TPKs活性和杀伤CSCs的多功能靶向治疗肿瘤策略,提高对肿瘤的治疗疗效,降低复发风险。本文第一章主要阐述了DAS和ATRA共给药抗黑色素瘤的研究背景及目的,为本课题提供理论支持。文本第二章以DAS为模型药物,以小鼠黑色素瘤B16F10细胞株为体外模型,初步考察了DAS对黑色素瘤的体外作用。MTT实验证实了DAS可以有效地抑制B16F10细胞的增殖,并呈剂量和时间依赖性。细胞划痕实验结果显示DAS对B16F10细胞的迁移能力有抑制作用。分别用低、中、高三个浓度的DAS处理B16F10细胞后,细胞形态发生改变,核裂解随浓度增加而加剧,并形成凋亡小体,其细胞凋亡率分别为(34.06±0.83)%、(50.24±1.66)%和(88.91±0.96)%。本文第三章为了解决肿瘤的复发、转移等问题,以DAS和ATRA为模型药物,设计并制备了基于DAS和ATRA的自组装共给药纳米粒(DAS/ATRA-NPs)。通过单因素试验考察了DAS和ATRA的投药量比、油相中乙醇和二氯甲烷体积比、油相与水相体积比及超声时间对制备DAS/ATRA-NPs的影响,优化了处方和制备工艺。透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)下观察到DAS/ATRA-NPs呈类椭球形,大小均一。用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析仪测得DAS/ATRA-NPs的平均粒径为(130.350±1.829)nm,多分散指数(PDI)为(0.247±0.013),Zeta电位为(26.617±0.939)m V。采用超滤法和超速离心法测得DAS和ATRA的包封率均达80%以上。在含10%乙醇的PBS释放介质中,DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA的释放速率小于游离药物,可见DAS/ATRA-NPs具有一定的缓释效果。DAS/ATRA-NPs在4℃的储存条件下放置一个月(30 d),其粒径、PDI及Zeta电位均无明显变化,未见聚集现象,稳定性良好。本文第四章主要以小鼠黑色素瘤B16F10细胞为体外模型,对DAS/ATRA-NPs进行了体外细胞学评价。选用香豆素-6来标记DAS/ATRA-NPs,通过流式细胞术检测香豆素-6的荧光强度发现B16F10细胞对DAS/ATRA-NPs的摄取具有良好的量效和时效关系。激光共聚焦显微镜下观察到香豆素-6标记的DAS/ATRA-NPs主要定位在细胞的胞浆中。在细胞毒性实验中,MTT实验结果表明DAS和ATRA均能够抑制B16F10细胞的增殖,且DAS/ATRA-NPs组的抑制作用强于DAS+ATRA组及ATRA组、DAS组,DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA产生了协同作用。利用细胞划痕实验及Transwell体外迁移实验说明药物处理后细胞的迁移性发生改变,DAS/ATRA-NPs能够有效地抑制B16F10细胞的迁移,其趋势与MTT结果相一致。细胞凋亡或死亡是肿瘤治疗中重要的考察因素,用DAPI染色液染核后发现,药物处理后的细胞出现了明显的染色质固缩、核膜破裂、核裂解等现象。流式细胞仪定量分析结果同样说明了这个问题,DAS/ATRA-NPs可以诱导B16F10细胞的凋亡并促进细胞的死亡。其细胞凋亡和死亡率显著的高于DAS+ATRA组及ATRA组、DAS组(P0.05)。接着,本章对DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA的协同机制进行了初步考察。细胞球囊形成实验和侧群细胞实验是两种常用的体外检测干细胞的手段。细胞球囊形成实验结果显示B16F10细胞能够在一定条件下形成细胞球囊,具有较强的致瘤性和类CSCs样特性。DAS/ATRA-NPs能够抑制细胞球囊的形成,且抑制作用强于其他组别。侧群细胞实验结果与细胞球囊形成实验结果一致,DAS/ATRA-NPs能够显著地抑制B16F10细胞的类CSCs样特性,且效果优于阳性对照维拉帕米。DAS可以抑制SRC激酶的磷酸化,用Western blot检测药物处理后SRC P-Y418和SRC的表达水平,结果显示SRC P-Y418受到药物调控表达水平下调,且DAS/ATRA-NPs组的SRC P-Y418表达量明显小于其他组别。以上实验说明DAS/ATRA-NPs能通过抑制类CSCs样特性和SRC激酶的磷酸化发挥协同抗黑色素瘤的作用。本文第五章主要考察了DAS/ATRA-NPs的体内分布情况。以5×106个细胞量腋下接种裸鼠,建立皮下异位肿瘤模型。用Di D荧光标记DAS/ATRA-NPs,尾静脉注射考察DAS/ATRA-NPs在荷瘤裸鼠体内的分布情况,IVIS Spectrum活体动物成像系统检测结果显示荧光主要分布在肝脏、脾脏及皮下异位肿瘤中。分别于2 h和24 h处死荷瘤裸鼠并解剖取出肿瘤,进行冰冻切片。激光共聚焦显微镜下观察发现DAS/ATRA-NPs组的肿瘤组织中Di D红色荧光更强,说明DAS/ATRA-NPs易被肿瘤细胞摄取并在肿瘤中富集,具有一定的肿瘤靶向性。24 h后肿瘤组织中DiD红色荧光减弱。综上所述,本文探索了新的肿瘤靶向治疗方式,在理论上丰富了肿瘤细胞治疗的研究内容,所构建的自组装共给药纳米系统具有多功能抗肿瘤的特性,有望为肿瘤的靶向治疗提供新的思路。
【学位授予单位】:第三军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R943

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