收藏本站
《第四军医大学》 2012年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

新脂肪因子CTRP3促进新生血管形成及机制研究

孙阳  
【摘要】:背景:鉴于糖尿病的高发病率,及其与心衰、慢性难愈性创面等疾病之间的关系,越来越多研究开始关注糖尿病与这些病理状态之间的内在联系。脂肪源性激素及细胞因子(脂肪因子)对心肌功能发挥重要的调节作用,大量的证据表明,大部分细胞因子(包括TNF-α、瘦素、TGF-β和抵抗素等)对心脏代谢、心肌细胞肥大、基质结构及其组成以及心肌细胞死亡起负性调节作用。虽然脂肪因子可促进细胞摄取糖,促进脂肪酸氧化,抵抗缺血/再灌注损伤,但是脂联素对慢性心肌重构及心衰发展的作用目前还是饱受争议。是否还存在其他的脂肪因子,对心肌缺血后心肌重构起到正性调节作用,改善心脏功能,目前尚未明确。是否某种脂肪因子可以促进伤口边缘血管化,从而加速伤口愈合目前受到人们的关注。 近来,人们发现了一个高度保守的脂联素同源异构物家族,即C1q肿瘤坏死因子相关蛋白(CTRPs)家族。CTRPs家族包括15个成员,CTRP1-CTRP15,其中CTRP8和CTRP10是人特异性的,每个成员都是由四个结构域组成的,包括N端的信号肽、短的可变区、胶原样结构域和C端的C1q样球状结构域。CTRPs和脂联素均属于C1q/TNF蛋白超家族,由于越来越多的C1Q结构域蛋白被发现,C1q/TNF蛋白超家族成员不断增加。尽管CTRPs家族成员的结构与脂联素十分相似,但却可以发挥许多不同的作用。近来有报道CTRP3第一个体内功能的研究,即CTRP3是一种维持血糖稳态的代谢调节因子。也有研究报道CTRP3可以在体外促进内皮细胞的增殖及迁移,但是CTRP3在动物体内,在心梗边缘区是否可以促进新生血管的形成,目前尚未见报道。而且,CTRP3作为一种最新发现的脂肪因子家族成员中的重要成员,对心梗后心肌重构会起到促进作用还是抑制作用,迄今尚未进行过相关研究。 目标:1)探讨CTRP3体外促进新生血管形成的作用及机制;2)探讨CTRP3是否可以在体内促进心梗边缘区新生血管的形成,及其心肌保护作用的机制;3)探讨CTRP3是否可以促进伤口边缘血管化,从而促进伤口愈合。 方法:合成制备CTRP3:PCR法合成CTRP3球形结构域基因序列,在原核蛋白表达载体pET45b中克隆其片段,DNA测序进行验证。体外实验:①成鼠心肌细胞培养:分离野生型小鼠成鼠心肌细胞,血清饥饿,使用Akt阻断剂LY294002阻断心肌细胞中Akt信号通路,阐明CTRP3促进血管化作用的机制。②HUVECs从ATCC购买。③小管形成实验:将HUVECs种植于胶上,无血清培养基培养,之后换成心肌细胞预处理培养基,6小时后观察小管形成情况,Image-Pro5.0软件进行分析,并利用VEGF阻断剂CBO-P11进行阻断研究。④检测生成NO的含量:检测CTRP3对HUVECs生成NO含量的影响。⑤Western blot分析蛋白表达:SDS-PAGE胶分离蛋白,转移至PVDF膜,用相应的抗体孵育,检测关注蛋白的表达。心梗模型:①缝扎小鼠心脏左主降冠状动脉,构建心梗模型。术后恢复后,将小鼠随机分为四组:即空白对照组,空白对照给CTRP3组,手术对照组,及手术给CTRP3组。2周后处死小鼠,在心梗边缘区进行Masson染色、免疫染色和Western blot等方法进行分析。②检测心脏功能:植入腹腔微量给药泵后2周,主要通过心脏超声和血流动力学检测心脏功能。③Masson染色的方法分析心脏梗死面积和胶原含量,切片进行CD31免疫组化染色和αSMA免疫荧光染色,检测血管标志物含量。④Western blot分析关注蛋白的表达。伤口愈合模型:①用打孔器在小鼠背部打直径6mm的孔,每天在创面边缘给CTRP3,剂量为2μg/kg/d,以给生理盐水组为对照,7天后处死小鼠。②观察并测量创面愈合情况及血管形成情况。③对切片进行HE染色,观察血管新生情况。④对切片进行CD31和αSMA免疫染色,检测新生血管形成情况。统计分析:用统计软件Prism进行统计分析,计算每组的均数和标准误,One-wayANOVA与LSD-t检验进行多组间相互比较的统计分析,认为P0.05有统计学差异。 结果: CTRP3不显著促进体外培养的内皮细胞(HUVECs)形成新生血管。体外全长CTRP3及CTRP3球状结构域作用并未见显著促进HUVECs形成管状结构,也没有促进NO的生成。而在体内CTRP3作用可显著激活缺血心肌Akt信号分子,增加HIF1-α及VEGF的表达,但是体外CTRP3作用HUVECs并不增加Akt信号激活,也不增加HIF1-α及VEGF的表达。 CTRP3促血管化作用是通过心肌细胞介导的Akt依赖信号通路实现的。CTRP3预处理的心肌细胞培养基可显著增加HUVECs细胞管状结构的形成,提示CTRP3是通过诱导心肌细胞旁分泌细胞因子促进血管化作用的。而且,CTRP3作用增加了培养心肌细胞中Akt的激活及HIF1-α和VEGF的表达,并且表现为时间和剂量依赖性。此外,我们用Akt抑制剂阻断Akt信号通路时,CTRP3无法增加心肌细胞中HIF1-α和VEGF的表达,预处理的培养基再处理HUVECs时,小管形成也未见增加。而且,当用VEGF特异性阻断剂阻断HUVECs细胞VEGF信号通路时,再用CTRP3预处理的心肌细胞培养基作用HUVECs细胞,不再促进管状结构的形成。外源性补充CTRP3可显著提高心梗后存活率,改善左室功能。外源性给予CTRP3可显著提高动物生存率(P0.05),而且可将左室收缩功能提高57%,dP/dtmax提高30.4%,左室收缩末压(LVEDP)降低17.6%,P0.05。 CTRP3作用抑制心梗后左室病理性心肌重构。我们通过大体观察、超声检测及Masson染色等观察心梗14天后心肌重构的程度。给予外源性CTRP3可以减小心脏大小和体积,减小左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD)。而且,外源性CTRP3作用可显著降低心梗边缘区间质纤维化(与MI+Veh相比降低41%),并显著增加缺血区肌细胞与纤维细胞的比例。 CTRP3在心肌梗死边界区通过激活Akt-HIF1α-VEGF通路促进血管化。我们通过CD31免疫组化染色评价CTRP3促血管化作用,发现CTRP3作用显著增加心梗边界区CD31阳性的毛细血管数量,并且增加α-SMA阳性的小动脉密度。CTRP3对AMPK及eNOs的激活并无明显作用,但是却可以显著激活Akt,增加HIF1α和VEGF表达。这些结果提示这一过程可能激活了Akt-HIF1α-VEGF信号通路。为验证CTRP3心肌保护作用是否是通过Akt-VEGF信号通路,我们在心梗模型的小鼠腹部植入载有Akt抑制剂LY294002和VEGF抑制剂CBO-P11的缓释泵,检测心脏功能及血管密度。与MI+CTRP3组相比,给予小鼠Akt抑制剂后,CTRP3改善心脏射血分数(LVEF)的能力明显受到抑制,促血管化作用也几乎消失。但是,虽然给予VEGF抑制剂和给予Akt抑制剂对CTRP3促血管化作用的抑制效果类似,但是给予VEGF抑制剂只是部分阻断了CTRP3的心脏保护作用。 CTRP3显著抑制心梗边缘区心肌细胞凋亡。TUNEL染色和Caspase3活性检测结果均表明CTRP3可显著减少细胞凋亡坏死。由于目前尚没有CTRP3-KO的小鼠,我们体外将3T3细胞诱导成脂肪前体细胞,用这种预处理的培养基与体外分离的成鼠心肌细胞共培养,验证缺血缺氧损伤时内源性的CTRP3是否可以起到心肌保护功能。提前48h给予诱导的3T3细胞CTRP3小干扰RNA及对照无关小干扰RNA,然后用预处理培养基与成鼠心肌细胞共培养,然后给予成鼠心肌细胞低氧处理(2%O2,12h),检测培养基中LDH释放量及成鼠心肌细胞Caspase3活性。与单独缺氧组(SI)相比,3T3细胞预处理培养基可显著减少成鼠心肌细胞凋亡坏死。而且,用小干扰RNA阻断诱导3T3细胞CTRP3表达后,3T3预处理培养基处理的成鼠心肌细胞释放的LDH含量和Caspase3活性显著提高。 CTRP3可显著促进创面血管化,加速创面愈合。CTRP3作用后3天,即可发现创面愈合速度较对照组显著增快,7天时伤口面积比对照组减小30%。对真皮下血管网拍照,HE染色及αSMA免疫染色分析,发现CTRP3作用可显著增加创面边缘新生血管的形成。 结论:我们的研究有几个重要的发现:本研究首次报道了CTRP3促进新生血管形成作用,是通过细胞与细胞之间相互作用的旁分泌途径实现的;本研究首次发现了CTRP3作为一种新发现的脂肪因子家族中的重要成员,可以显著提高心梗边缘区新生血管的形成,抑制心肌细胞凋亡,实现对缺血心肌的保护作用;我们首次发现CTRP3在缺血心肌促进新生血管形成是通过激活了Akt-HIF1α-VEGF信号通路实现的,进一步阐明了CTRP3促进新生血管形成作用的机制,为进一步研究打下坚实基础;我们首先观察到脂肪因子CTRP3可以显著促进创面边缘新生血管形成,从而加速伤口愈合,为促进创面愈合提供了新的治疗靶点。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R587.1

【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 叶秀荣;金玲;;玻璃体在视网膜中央静脉阻塞中对眼后段新生血管形成的作用[J];国际眼科纵览;1992年01期
2 顾卫东;薛庆生;于布为;;血管内皮生长因子:从血管形成到神经元保护[J];国际麻醉学与复苏杂志;2006年06期
3 范应方,聂晶;血管内皮生长因子D和血管内皮生长因子E[J];国外医学.生理.病理科学与临床分册;2002年01期
4 朱鹏;郑朝新;陈道达;时德;;Ang-2在胃癌组织中表达与胃癌新生血管形成的关系[J];咸宁学院学报(医学版);2005年06期
5 冯霞;刘哲丽;;PEDF与视网膜新生血管[J];国际眼科杂志;2006年05期
6 张琼;周颖明;张士胜;朱彩红;王玲;;氧诱导小鼠视网膜组织VEGF和iNOS的早期表达及意义[J];眼科研究;2007年07期
7 陈宜;黎晓新;董建强;;氧诱导小鼠视网膜新生血管的实验研究[J];眼科研究;2008年02期
8 杜国强;王敏;;复制缺陷性型腺病毒AdCMV-VEGF促进静脉皮瓣成活的实验研究[J];组织工程与重建外科杂志;2008年03期
9 段才闻;严鹏科;;microRNAs与血管系统发生及疾病的研究进展[J];现代生物医学进展;2009年05期
10 林芳;高晓唯;任兵;肖云;杨玉洁;;Avastin对大鼠角膜新生血管的抑制及超微结构的影响[J];国际眼科杂志;2009年04期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭亮生;刘爱民;;子宫颈病变中Endostatin的表达及其与MVD的相关性研究[A];东北三省第四届妇产科学术会议论文汇编[C];2008年
2 赵鸿鹏;卢俊;;血管内皮生长因子与原发性肝细胞肝癌[A];山东抗癌协会普外肿瘤专业委员会第三次学术会议论文汇编[C];2006年
3 冯强;;纤溶酶原Kringle 5对角膜新生血管形成的影响[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
4 陈梅;彭清华;;年龄相关性黄斑变性脉络膜新生血管的中西药物治疗进展[A];中华中医药学会第七次眼科学术交流会论文汇编[C];2008年
5 郭贵龙;尤捷;周素梅;胡晓渠;金纯;杨凯;张筱骅;;Nimesulide对人乳腺癌肿瘤血管形成因子的影响[A];2007年浙江省肿瘤外科学术年会暨温州医学会肿瘤分会第四届年会论文汇编[C];2007年
6 李沭岩;吴雅臻;崔妤;;重组人血管抑制因子Vasostatin对脉络膜新生血管抑制作用的实验研究[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年
7 张鸿坤;吴丽花;金炜;李鸣;封华;赵海格;陈旭东;杨春虎;;自体骨髓CD_(34)~+干细胞移植治疗严重肢体缺血的实验研究[A];浙江省中西医结合学会周围血管疾病专业委员会第一次学术年会暨省级继续教育学习班资料汇编[C];2005年
8 顾卫东;于布为;;血管内皮生长因子:从血管形成到神经元保护[A];2006年中华医学会全国麻醉学术年会知识更新讲座[C];2006年
9 代梅;缪泽鸿;林莉萍;丁健;;MFTZ-1通过HIF依赖和非依赖的途径抑制新生血管形成[A];2007医学前沿论坛暨第十届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2007年
10 林方才;邓海;;血管内皮生长因子受体KDR在大肠癌发展中的研究[A];中国水利电力医学科学技术学会临床医学专业委员会外科专业、护理专业2007年会论文汇编[C];2007年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 杨洋;骨髓细胞生成心肌细胞[N];卫生与生活报;2003年
2 编译 晓鱼;人类心肌细胞可再生[N];医药经济报;2009年
3 记者 郑晓春;以科学家用皮肤细胞制造出心肌细胞[N];科技日报;2009年
4 刘霞;美成功将成纤维细胞直接变为心肌细胞[N];科技日报;2010年
5 记者 张晔;基因调控让坏死的心肌细胞“复活”[N];科技日报;2011年
6 艾平 编译;加拿大骨髓干细胞培植心肌细胞[N];大众科技报;2000年
7 吴伟农;心肌细胞能自我修复[N];医药经济报;2001年
8 ;急性心梗治疗获重要突破 心肌细胞可以再生[N];中国保险报;2003年
9 记者 张孟军;加发现心肌细胞再生法[N];科技日报;2000年
10 记者胡德荣;心肌细胞能体外培养[N];健康报;2002年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 孙阳;新脂肪因子CTRP3促进新生血管形成及机制研究[D];第四军医大学;2012年
2 张郁青;自体骨髓干细胞移植治疗心肌梗死的基础及临床研究[D];南京医科大学;2006年
3 孙宇扬;双参宁心胶囊干预心肌缺血的分子机制研究[D];中国中医科学院;2006年
4 马丽娟;大豆异黄酮对心肌的保护作用及其机制研究[D];吉林大学;2006年
5 储全根;加味桃核承气汤及其不同提取物对糖尿病大鼠心肌和主动脉病变的影响[D];广州中医药大学;2005年
6 孙彦洵;Smad5基因在小鼠胚胎干细胞增殖、分化及凋亡中的功能与机制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
7 秦川;EPO预处理在心肌缺氧复氧损伤中的保护作用及其NF-κB信号机制的研究[D];第三军医大学;2005年
8 李曦铭;基因重组hVEGF165腺相关病毒的构建及其在间充质干细胞和心肌细胞中的表达[D];天津医科大学;2006年
9 邹安若;心肌萎缩对大鼠心肌移植细胞钾通道的影响[D];华中科技大学;2004年
10 韩冬云;钙调蛋白对豚鼠心室肌细胞Cav1.2钙通道的剂量依赖性和钙依赖性作用[D];中国医科大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 刘井波;镰刀菌毒素丁烯酸内酯对心肌的毒性作用机制[D];中国人民解放军军事医学科学院;2005年
2 姜雪松;新生SD大鼠心肌细胞培养方法的研究[D];昆明医学院;2004年
3 郭军;细胞因子预处理对骨髓间充质干细胞增殖分化的影响[D];武汉大学;2005年
4 李建荣;丙泊酚对肿瘤坏死因子诱导的心肌细胞凋亡的影响[D];山西医科大学;2007年
5 王澎;血管紧张素Ⅱ AT_1受体自身抗体对大鼠心室肌细胞动作电位和心肌变力性的影响[D];山西医科大学;2007年
6 李卫东;体外模拟心肌微环境下胚胎干细胞向心肌样细胞分化的实验研究[D];重庆医科大学;2008年
7 阴文杰;钙调磷酸酶与心肌凋亡的关系探讨及卡维地洛的干预研究[D];山西医科大学;2008年
8 冯德光;内毒素血症大鼠心肌细胞骨架蛋白基因表达的变化[D];南方医科大学;2008年
9 陶思尧;人胚胎多潜能干细胞向心肌样细胞转化的研究[D];吉林大学;2009年
10 盛小伍;银杏内酯B诱导胚胎干细胞定向分化为心肌细胞的研究[D];华中科技大学;2008年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026