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聚酰胺—胺树状大分子抗菌作用研究及其机理探讨

薛小燕  
【摘要】:目的: 由于抗生素滥用导致的各种细菌耐药在全世界范围的蔓延愈演愈烈,许多原本可以治愈的感染性疾病,正在成为难以治愈的疾病。耐药细菌的感染导致患者死亡率增加,感染并发症增多,耐药致病菌感染所致疾病已成为全人类共同的灾难。当前细菌耐药已呈现出向多药耐药发展的趋势,一些细菌已经演变为难以控制的“超级细菌”。更为严峻的是能够抵抗所有抗生素的全耐药细菌(pan resistant bacteria)已经出现,一旦人类感染这类细菌,可能会面临无药可治的境地。面对多重耐药细菌日趋增多和迅速蔓延,以及感染后致死率继续攀高的严峻形势,如何有效控制多重耐药细菌感染造成的危害已经成为各国政府高度关注的焦点,寻找和研制有效控制多重耐药细菌感染的新策略和新药物,已成为当今世界各国科学家当务之急的研究目标。 抗生素是治疗细菌感染最经典的药物,然而几乎所有抗生素在治疗细菌感染时都会不可避免地诱导细菌耐药。近半个世纪以来,抗生素研发策略仍局限于传统抗生素结构改造和修饰,新抗生素用于临床后细菌又会很快产生耐药,故新型抗生素的研制并不能从根本上解决细菌耐药问题。而且抗生素耐药菌株的出现速度已经远远超过了新抗生素研发的速度,临床有效的抗菌药物日趋减少。为了有效对抗日益严重的耐药细菌,必须突破传统思路,寻找具有新型结构且不诱导耐药的抗菌药物。 聚酰胺-胺(polyamidoamine, PAMAM)是一种人工合成的纳米级大分子化合物,由于具有单分散性、内部空腔及表面丰富的可修饰基团等独特结构优势,PAMAM在生物医药领域,如基因药物载体、助溶剂、高效催化剂及纳米材料等方面,有非常广泛的应用和研究。新近研究发现,高代数氨基末端的PAMAM(PAMAM-NH2)体外具有显著的抗菌活性,如G3.0和G5.0能显著抑制铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(S. aureus)的生长。与现有的各类抗生素和抗菌药物的分子结构相比较,PAMAM-NH2是一类结构新颖的抗菌分子,其抗菌作用可能与其末端氨基数目有关。PAMAM-NH2合成方法成熟,目前市售有G1.0-G10.0等数十种,随着代数的增加,PAMAM纳米尺寸、末端氨基数目、形状和结构特征也会随之变化。那么,究竟PAMAM-NH2是否可以成为理想的抗菌候选分子,目前尚无明确的结论。回答上述问题至少应当明确: PAMAM-NH2的抗菌活性与其代数之间存在何种规律; PAMAM-NH2的抗菌谱主要包括哪些?PAMAM-NH2的体内毒性如何; PAMAM-NH2对细菌和哺乳类细胞的选择性如何; PAMAM-NH2在感染动物体内是否具有抗菌作用;PAMAM-NH2是否诱导细菌耐药;○7PAMAM-NH2可能的作用机理是什么;○8如何提高PAMAM-NH2靶向抗菌作用从而降低其毒性。本课题针对上述未知领域展开了系统研究,旨在全面评价PAMAM-NH2作为新型抗菌剂的可能性,并探讨其可能的抗菌作用机理。 方法: 1. G1.0-G4.0PAMAM-NH2体外抗菌活性的研究: 分别测定G1.0-G4.0PAMAM-NH2对17株检测菌株(包括6株耐药菌株)的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC);测定G1.0-G4.0PAMAM-NH2对大肠埃希菌E.coli MG1655和对万古霉素中度耐药的S.aureus Mu50的生长抑制情况;通过平板克隆形成实验,计数产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)的大肠埃希菌(ESBLs-EC)和耐甲氧西林的S. aureus(MRSA)的菌落数(CFU),观察G1.0-G4.0PAMAM-NH2对其生长的抑制程度。 2. G1.0-G4.0PAMAM-NH2对人胃黏膜上皮细胞(GES-1)的毒性研究 通过MTT实验检测G1.0-G4.0PAMAM-NH2对GES-1的细胞毒性。 3. G2.0PAMAM-NH2诱导细菌耐药性的研究 分别测定G2.0PAMAM-NH2对受试菌株ESBLs-EC和S. aureus ATCC29213的MIC值,每天测定1次,连续15天,计算待测药物对第15代培养细菌的MIC值与第1代培养细菌的MIC值的相对值。 4. G2.0-G4.0PAMAM-NH2对ESBLs-EC和MRSA生物被膜形成的影响 将G2.0-G4.0PAMAM-NH2分别与ESBLs-EC和MRSA共培养7天,通过银染法检测PAMAM-NH2对生物被膜形成的影响;待生物被膜形成后,分别加入不同浓度的G2.0PAMAM-NH2培养24后,计算生物被膜内活菌数目以检测G2.0PAMAM-NH2对被膜菌的抑制能力。 5. G2.0PAMAM-NH2对BALB/c小鼠急性毒性研究 通过改良寇氏法急性毒性实验方法,评估腹腔注射G2.0对BALB/c小鼠的半数致死剂量,并通过小鼠脏器组织HE染色,观察G2.0对BALB/c小鼠各个脏器的毒性损伤。 6. G2.0PAMAM-NH2对脓毒血症感染动物的治疗作用 分别构建ESBLs-EC感染BALB/c小鼠脓毒血症模型和ESBLs-EC与MRSA混合感染的BALB/c小鼠脓毒血症模型,观察腹腔注射10mg/kg、20mg/kg及10+10mg/kg (感染前12h和感染后0.5h分别给予一次)G2.0对小鼠生存时间及生存率的影响;通过测定BALB/c小鼠血液CFU,观察G2.0对小鼠血液菌落数的影响;通过小鼠肺脏和肝脏组织HE染色,观察G2.0PAMAM-NH2对脓毒血症小鼠脏器的保护作用。 7. G2.0PAMAM-NH2抗菌作用机理探讨 将ESBLs-EC分别与G2.0PAMAM-NH2作用30、120、300min,通过扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)观察细菌形态学和微观结构变化。 8. meta-LED209-PAMAM G3.0的合成、表征及活性检测 经系统的文献查阅分析后发现,LED209是一种新发现、强效且无毒的革兰氏阴性菌膜受体QseC抑制剂,能有效抑制QseC与信号分子结合,进而抑制下游致病基因的表达。为进一步提高PAMAM抗菌作用的靶向性,故本实验选择LED209化学修饰PAMAM G3.0,旨在得到具有细菌靶向且安全低毒的新型抗菌分子。 (1)LED209羧基衍生物的合成、表征及活性检测 设计并合成苯环对位及间位LED209羧基衍生物para-LED209-COOH和meta-LED209-COOH,经质谱和核磁共振氢谱(1H NMR)结构表征,经高效液相色谱(HPLC)测定纯度;通过检测不同浓度的para/meta-LED209-COOH对肠出血性大肠杆菌(EHEC)生长曲线的影响,评估其体外抑菌活性;PCR法检测不同浓度的para/meta-LED209-COOH对EHEC菌膜QseC受体下游基因表达的抑制情况,评价para/meta-LED209-COOH拮抗QseC受体的活性差异。 (2)meta-LED209-PAMAM G3.0的合成、表征及活性检测 合成meta-LED209-PAMAM G3.0,通过1H NMR和核磁共振碳谱(13CNMR)进行结构鉴定,经元素分析计算终产物结构组成;通过检测G3.0meta-LED209-PAMAM对12株革兰氏阴性菌(包括3株耐药菌株)的MIC值,与G3.0PAMAM比较,判断其抗菌活性的变化;PCR法检测不同浓度的G3.0meta-LED209-PAMAM对EHEC致病基因表达的影响,评估其对QseC受体的抑制效率;MTT法检测不同浓度的G3.0meta-LED209-PAMAM对GES-1、SW480和MC3T3细胞的毒性,判断其细胞毒性的变化;合成G3.0PAMAM-FITC和G3.0FITC-PAMAM-LED209,通过紫外分光光度计计算FITC的含量;将标记FITC的G3.0和G3.0-LED209,分别与EHEC和SW480共孵育,与不同时间点荧光显微镜观察,判断LED209修饰的G3.0与EHEC和SW480亲和力的差别。 结果: 1. G1.0-G4.0PAMAM-NH2体外抗菌活性的研究 MIC结果表明G1.0-G4.0PAMAM-NH2体外抗菌谱广,对革兰氏阳性菌、阴性菌的敏感和耐药菌株均有不同程度的抑制和杀灭作用,其中G2.0作用最强(MIC值为0.78-12.5μg/mL),G3.0和G4.0次之(MIC值为1.56-25μg/mL),G1.0作用最弱(MIC≥50μg/mL);MBC结果提示,G2.0PAMAM-NH2对所测菌株的MBC是MIC值的2-4倍;生长曲线提示,PAMAM-NH2抗菌作用呈浓度依赖效应,且同等浓度下,G2.0抗菌作用最强;杀菌曲线提示,12μM G2.0-G4.0PAMAM-NH2对ESBLs-EC和MRSA具有显著的杀菌活性,G2.0与ESBLs-EC作用2h后活菌计数即接近零,MRSA作用6h后活菌计数接近零,而60μM G1.0未显示杀菌作用。 2. G1.0-G4.0PAMAM-NH2对GES-1的细胞毒性研究 MTT结果提示,PAMAM-NH2的细胞毒性与浓度和代数呈正相关,即浓度和代数越高,毒性越大。在所检测的最高浓度1024μg/mL时,G1.0处理组显示无细胞毒性(P0.05),G2.0和G3.0浓度≤102.4μg/mL时,细胞生存率无显著性变化(P0.05),而G4.0浓度≥0.512μg/mL时,即呈现明显的细胞毒性(P0.05)。 3. G2.0PAMAM-NH2诱导细菌耐药研究 耐药性实验结果表明,与ATCC29213共孵育连续培养15代后,G2.0、红霉素、苯唑西林和头孢他啶的MIC与第1代培养所测MIC的相对比值,分别是1、64、8和8;与ESBLs-EC共孵育连续培养15代后,G2.0、左氧氟沙星、氨苄西林和头孢他啶所测MIC与第1代培养所测MIC的相对比值,分别是1、64、32和8,提示ATCC29213和ESBLs-EC不易对G2.0PAMAM-NH2产生耐药,而容易对抗生素产生耐药性。 4. G2.0-G4.0对ESBLs-EC和MRSA生物被膜的抑制 银染法结果证实20μg/mL G2.0-G4.0PAMAM均可减少黑色棉絮样膜状物,可抑制ESBLs-EC和MRSA生物被膜的形成;而ESBLs-EC和MRSA被膜菌对左氧氟沙星和G2.0PAMAM均具有抵抗性。 4. G2.0PAMAM-NH2对BALB/c小鼠急性毒性研究 BALB/c小鼠腹腔注射G2.0急性毒性结果表明,LD50的平均可信区间为84.04±21.72mg/kg;HE染色结果显示,腹腔注射180mg/kg G2.0后,小鼠各脏器(心、肝、脾、肺、肾)均有微血栓形成,可见明显的血管内凝血和出血,其中肝脏、肾脏最为严重,肺脏损伤较轻,血栓形成较少见。 5. G2.0PAMAM-NH2对脓毒血症感染动物的治疗作用 ESBLs-EC所致的BALB/c小鼠脓毒血症模型实验中,10+10mg/kg和20mg/kg组G2.0PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间,与模型组相比,生存率分别从0%提高至100%(P0.01)和41.67%(P0.05),并显著降低小鼠血液CFU计数(P0.05和P0.01),明显减轻小鼠肺脏和肝脏损伤;对ESBLs-EC和MRSA混合感染所致的BALB/c小鼠败血症模型实验中,10+10mg/kg和20mg/kg组G2.0PAMAM-NH2可显著延长小鼠的生存时间,与模型组相比生存率分别从0%提高至60%和40%(P0.05)。 6. G2.0PAMAM-NH2抗菌作用机理探讨 SEM结果提示,G2.0PAMAM-NH2和ESBLs-EC作用后,大部分菌体长度变短,菌体表面凹陷或严重缺损,且受损程度随作用时间延长而加重;TEM结果提示,PAMAM-NH2和ESBLs-EC作用后,可导致细菌细胞壁疏松、肿胀,甚至完全溶解,细菌胞膜缺损,胞质成分丢失形成空泡结构。 7.靶向meta-LED209-PAMAM G3.0的合成、表征及活性检测 (1)LED209羧基衍生物的合成、表征及活性检测 meta/para-LED209-COOH两种羧基衍生物,经质谱、核磁表征,结构正确,经高效液相色谱测定,纯度大于95%,符合实验要求;生长曲线结果提示,10-100μM meta/para-LED209-COOH体外不影响EHEC的增殖; PCR法检测发现1μM meta/para-LED209-COOH均可拮抗NE对QseC受体的激活作用,显著抑制下游关键致病基因stx2A、flhD、fliC和ler的表达,并且meta-LED209-COOH拮抗活性高于para-LED209-COOH。 (2)meta-LED209-PAMAM G3.0的合成、表征及活性检测 通过1H NMR和13C NMR分析得知,meta-LED209-COOH与PAMAMG3.0成功偶联,根据元素分析结果计算,平均每一个PAMAM分子末端连接有1.89个LED209分子,得到产物meta-LED209-PAMAM(n=1.89);MIC检测结果表明G3.0meta-LED209-PAMAM对所检测12株革兰氏阴性菌,S.typhimurium和ESBLs-KP除外,均有很强的抗菌活性,其MIC值是PAMAM G3.0MIC值的1-2倍; PCR法检测发现,10μMmeta-LED209-PAMAM(n=1.89)即可与QseC受体结合并拮抗NE作用,显著抑制EHEC下游关键致病基因的表达;MTT检测结果表明,与G3.0PAMAM处理组相比,G3.0meta-LED209-PAMAM(n=1.89)对GES-1、SW480和MC3T3的细胞毒性明显降低(P0.05);合成得到G3.0PAMAM-FITC(8.69mg)和G3.0FITC-PAMAM-LED209(10.03mg),平均每个分子均连有3个FITC;荧光显微镜观察发现,与G3.0PAMAM相比,G3.0FITC-PAMAM-LED209对EHEC亲和力明显提高,对SW480亲和力降低。 结论: 1.发现G1.0PAMAM体外抗菌活性最差,G2.0-G4.0活性相当,其中G2.0活性略强。 2.发现G1.0-G4.0PAMAM细胞毒性与代数呈正相关,代数越高,毒性越大,其细胞毒性顺序为G1.0G2.0G3.0G4.0。 3.证实G2.0-G4.0体外具有广谱抗菌效应,且对多种耐药菌株MRSA、万古霉素中度耐药的S. aureus Mu50、ESBLs-EC及MDR-EC有效。 4.证实G2.0-G4.0可以抑制ESBLs-EC和MRSA生物被膜的形成,但已形成生物被膜的细菌对其具有抵抗性。 5.证实ESBLs-EC和S. aureusATCC29213对G2.0PAMAM不易产生耐药。 6. PAMAM-NH2对哺乳类细胞和细菌细胞的损伤强度与代数密切相关,并对细菌的损伤强度高于哺乳类细胞,这种选择性差异可能与不同类型细胞体积大小相关,即同等浓度的PAMAM,相对于真核细胞的电荷密度小于相对于细菌的电荷密度,故对哺乳动物细胞的作用小于对细菌的作用。 7.证实感染前12h和感染后0.5h分别给予腹腔注射10mg/kg G2.0PAMAM-NH2,可显著提高ESBls-EC和ESBLs-EC与MRSA混合感染所致脓毒血症BALB/c小鼠的生存率,在整体动物上显示出显著的抗感染治疗效果。 8.合成meta-LED209-PAMAM(n=1.89),在不显著影响其抗菌活性的同时,明显降低PAMAM细胞毒性,并可提高对EHEC的亲和力,同时通过抑制QseC受体抑制EHEC关键致病基因的表达,为实现其靶向抗菌作用奠定了基础。


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