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《第四军医大学》 2013年
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miR-340调控UVB诱导的黑素细胞树突形成的机制研究

安庆  
【摘要】:人体皮肤的颜色主要受色素沉着过程的影响,色素沉着过程也就是黑素代谢的生理过程,包括黑素合成、转运、再分布和降解。在多种外界环境因素和生理因素影响下,机体形成一个复杂而有序的色素沉着调控网络。色素沉着异常在临床上表现为多种色素障碍性皮肤病,发病机制尚不完全清楚。 黑素转运是色素沉着过程中最为关键的一个环节,黑素合成后,必须由黑素细胞进入角质形成细胞,才能形成皮肤颜色并保护机体免受紫外线辐射损伤。黑素转运主要分为①细胞内转运:黑素细胞内合成的黑素小体由核周向树突末端运动;②细胞间转运:运动至树突末端的黑素小体分泌进入周围角质形成细胞。树突是黑素细胞的特征性结构,作为黑素小体的运动管道和连接黑素细胞与角质形成细胞的重要中介,树突在黑素转运中起着至关重要的作用。紫外线是引起色沉增加的重要影响因素,紫外线照射在刺激黑素细胞黑素合成的同时,通过增加树突数量及长度实现更高效的黑素转运。有学者通过体外重建表皮模型证实中波紫外线(UVB)照射显著促进黑素小体转运,镜下观察黑素颗粒在表皮全层分布,黑素细胞数量及形态发生明显变化。我们在前期实验中也证实UVB照射后可以诱导人黑素细胞PIG1树突数量及长度显著增加,黑素小体向角质形成细胞的传递增强,但具体机制尚未完全阐明。 microRNA(miRNA)是一类长约22个nt的非编码单链小RNA分子,可以通过与其调控的靶基因之间特异性的结合,降解靶mRNA或抑制翻译等方式在转录后水平调控靶基因表达,进而参多种生物学功能,在细胞内具有重要的调节作用。miRNAs表达的时序性和组织特异性提示miRNAs的分布可能决定细胞和组织的功能特异性。既往有研究表明一些microRNAs参与调控神经细胞树突棘发育[6-8],还有很多报道miRNAs分子通过调控细胞骨架蛋白等信号通路,在细胞形态学发生、迁移及运动中发挥重要的调控作用。此外,研究发现紫外线可以引起细胞内microRNA表达谱变化,miRNAs分子可以在转录后水平参与调控对UV诱导DNA损伤的应答机制]。以上提示我们在黑素细胞内可能存在特定的miRNAs分子参与调控树突形态。因此,本课题拟在前期研究的基础上,选择100mJ/cm2UVB作为诱导条件,寻找与人表皮黑素细胞树突形成相关的microRNA分子,研究miRNAs调控黑素细胞形态的分子机制及其在UVB诱导的树突形成中的作用,完善黑素代谢基础理论,探讨miRNAs参与紫外线诱导皮肤色沉的分子机制,并为色素障碍性皮肤病的治疗以及皮肤美容产品的研发提供新的思路和理论依据。 实验方法 使用100mJ/cm2UVB照射人表皮黑素细胞PIG1,与UVB照射前的黑素细胞进行microRNA表达谱差异分析,再通过Real-timePCR验证芯片结果,初步筛选相关的miRNA分子。转染miRNA分子进行形态学和功能学研究,观察黑素细胞树突数量及长度的变化,观察骨架蛋白F-actin和黑素小体在树突的分布变化。生物信息预测软件预测miRNA可能调控的靶基因,双荧光素酶报告载体验证预测的靶基因,RT-PCR、WesternBlot证实miRNA分子对靶基因的调控作用。 结果 1.对microRNA芯片表达谱进行分析后,我们发现与对照组相比,UVB照射后很多microRNA表达水平发生变化,UVB照射后3h与对照组相比有12个miR分子表达变化(Foldchange≥2.0),其中2个下调,10个上调。UVB照射后24h,有3个显著变化的miR分子(Foldchange≥2.0),其中1个上调,3个下调。 2.在黑素细胞中转染miR-340拟似物和抑制物后,分别成功上调和下调miR-340表达水平,与对照组相比,上调miR-340表达水平后,黑素细胞树突数量、长度均显著增加(p<0.05);免疫荧光观察到细胞内F-actin形成的应力纤维解聚,黑素小体在树突末端的分布增加。 3.通过生物学软件我们预测RhoA是miR-340的靶基因,报告基因实验证实,miR-340可以与RhoA3’UTR的预测位点特异性结合,RT-PCR和Westernblot实验发现上调miR-340表达水平,RhoA的mRNA表达水平无明显变化,而RhoA蛋白水平显著下调;下调miR-340表达水平,RhoA的mRNA无变化,蛋白水平上调。 结论 1.UVB照射可以诱导人黑素细胞PIG1的microRNA表达谱发生变化,靶基因预测和功能学分析提示microRNA可能参与多种生物学功能;UVB照射后microRNAs表达的时间差异性,提示UVB诱导的miRNAs表达具有瞬时性,并且多集中于UVB照射早期。 2.miR-340在UVB照射前后的人黑素细胞表达具有差异性;miR-340能够促使PIG1细胞内应力纤维解聚,黑素细胞树突长度及数量增加,黑素小体向树突末端的转运增加,说明miR-340在黑素细胞树突形成及黑素转运中的调控作用。 3.miR-340可能通过与靶基因RhoA3’UTR区的作用位点特异性结合抑制RhoA表达,参与黑素细胞树突形成。RhoA是调控骨架蛋白F-actin的重要分子,它可以促进F-actin聚合形成应力纤维,增加细胞张力及粘附力,使黑素细胞树突回缩、变短,是黑素细胞树突形成的负调控分子。miR-340对黑素细胞树突形成的促进作用可能是通过对RhoA的靶向抑制作用实现的。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R751

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