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《第四军医大学》 2013年
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细胞自噬促进拉帕替尼抗HER2阳性乳腺癌的机制研究

朱星枚  
【摘要】:乳腺癌是严重威胁全球女性健康的恶性肿瘤,约占女性肿瘤的四分之一。近年来我国的乳腺癌发病率和死亡率也都呈明显上升趋势,且发病年龄趋于年轻化。HER2(ErbB2)阳性乳腺癌约占乳腺癌总数的25%左右,肿瘤进展快、易复发、易转移且预后不佳。因此,开发针对HER2的分子靶向治疗药物始终是这一领域的研究热点。曲妥珠单抗(Trastuzumab)作为人源化的抗HER2抗体,在HER2靶向治疗中应用最为广泛和成熟。但是,仅有35%左右的HER2阳性乳腺癌患者对Trastuzumab治疗有效,并且大多数的患者在接受Trastuzumab治疗1年左右出现耐药。因此,亟需开发新的针对HER2的靶向性药物。 拉帕替尼(Lapatinib)作为新的HER2靶向治疗性小分子抑制剂,可以同时竞争结合EGFR和HER2胞内段激酶区域的ATP结合位点,从而抑制HER2阳性乳腺癌细胞的增殖。2010年,FDA批准Lapatinib与卡培他滨(Capecitabine)合并治疗晚期或转移性乳腺癌。Lapatinib可明显延长患者的生存时间,对复发性晚期或转移性乳腺癌具有显著疗效。相对于Trastuzumab,Lapatinib具有可口服、易进入细胞内发挥药理作用、同时拮抗EGFR和HER2两种受体的信号通路、易透过血脑屏障治疗乳腺癌脑转移等独特优势。并且Lapatinib对于Trastuzumab治疗失败的进展期患者依然有效,这使得人们对Lapatinib的应用前景十分看好。但是,Lapatinib的临床治疗反应性仅有24%左右,是否可通过与其它药物的联合应用,提高其治疗效果呢? 研究表明,HER2阳性乳腺癌患者中,HER2基因的过表达会激活下游信号分子的级联链锁反应;HER2的高表达可以促使PI3K、Akt、mTOR、p70SK等过度磷酸化,促进肿瘤细胞的增殖。而Lapatinib主要通过阻断PI3K、Akt等信号通路抑制HER2阳性乳腺癌细胞的增殖。已有明确的实验证据显示:PI3K/Akt/mTOR、LKB1/AMPK/mTOR等信号通路是细胞自噬发生的主要上游调控分子。细胞自噬犹如一柄双刃剑,可以抑制肿瘤的形成,也可以促进肿瘤细胞的生存。究竟细胞自噬在肿瘤细胞生存过程中是发挥保护作用还是发挥抑制作用,一直存在争议。那么,细胞自噬是否参与了Lapatinib的抗肿瘤作用呢?这是本课题需要解决的关键问题之一。 非甾体抗炎药(Nonsteroidal Antiinflammatory Drugs,NSAIDs)和他汀类药物(HRIS)是一类具有较广谱抗肿瘤作用的经典药物。《柳叶刀》杂志报道,每天服用少量阿司匹林片(Aspirin)可以有效降低多种肿瘤的发病率,甚至可以治疗肿瘤。洛伐他汀(Lovastatin)亦被证实可使乳腺癌MCF-7细胞的超微结构发生一些正向分化的表现。而NSAIDs和HRIS都具备长期用药经验,且现在对其抗肿瘤机制的研究也逐渐深入。Aspirin在结肠癌细胞中可以抑制mTOR,激活AMPK通路而抑制结肠癌细胞的增殖和迁移。那么,NSAIDs或HRIS与Lapatinib是否可以联合应用以增强Lapatinib对HER2阳性乳腺癌的治疗效果,这一研究将为HER2阳性乳腺癌患者提供有效的治疗方案。因此,本课题将分析Aspirin、水杨酸钠(Sodium Salicylate)、Lovastatin分别与Lapatinib联合应用后,对HER2阳性乳腺癌发生发展的生物学特征,并阐明可能的机制。 在本课题中,我们首先利用MTT、平板克隆、EDU等检测手段研究了Lapatinib对HER2阳性乳腺癌细胞BT474和AU565的抗增殖能力,并通过细胞形态学观察、流式细胞术、蛋白免疫印迹检测凋亡蛋白的表达水平,并确定了其诱导凋亡能力及其对HER2及下游分子的影响。进一步,通过透射电镜、AO染色、GFP-LC3转染、蛋白免疫印迹等技术证实Lapatinib可以诱导HER2阳性乳腺癌细胞发生自噬。随后我们发现,经细胞自噬抑制剂3-MA预先处理2h后,Lapatinib诱导BT474和AU565细胞的自噬能力被抑制,细胞增殖能力明显增强,细胞周期S期的阻滞亦有缓解。凋亡分子Caspase-3和PARP分解减少,流式细胞术显示凋亡率亦有明显减少。最后,通过Western-blot分析发现,3-MA可以解除Lapatinib对HER2及其下游通路mTOR/p70SK/Akt的抑制作用。同时,自噬相关蛋白AMPK的表达被3-MA下调。因此,Lapatinib可诱导BT474和AU565细胞自噬,并有助于其促进肿瘤细胞凋亡。该结果对理解细胞自噬在肿瘤治疗中的功能具有重要价值,同时也为HER2阳性乳腺癌的联合用药提供了新的靶点。 本课题中我们首次将Aspirin、Sodium Salicylate等NSAIDs及Lovastatin分别与Lapatinib联合应用,通过MTT实验、平板克隆形成,及EDU染色实验均证实低剂量NSAIDs及Lovastatin与Lapatinib联合作用可以协同Lapatinib对HER2阳性乳腺癌细胞增殖的抑制作用。AO染色发现低剂量NSAIDs或Lovastatin短时间作用时,可以诱导BT474和AU565细胞的自噬,而高剂量长时间作用则以杀伤作用为主。细胞自噬可能是联合用药发挥协同作用的机制之一。 在本课题中,我们对细胞自噬在Lapatinib单药及其与NSAIDs或HRIS联合用于抗HER2阳性乳腺癌细胞增殖的机制研究中只揭开了冰山一角,如果细胞自噬确实可以作为HER2肿瘤治疗的新靶点,那么联合NSAIDs或HRIS等经典药物将为HER2阳性乳腺癌的治疗提供更有效的治疗方案。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R966;R737.9

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【参考文献】
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