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《第四军医大学》 2013年
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肝癌中c-Myc介导的microRNA-101表观沉默机制及功能研究

王磊  
【摘要】:【背景】 MicroRNA(miRNA)分子是近年来发现的一类普遍存在于动植物体内的内源性非编码小RNA分子,它的广泛下调是包括肝癌在内的众多肿瘤的一个显著特征。miRNA分子可通过序列特异性的互补识别,在转录后水平抑制靶mRNA的翻译或将其降解来负性调控下游基因。miRNA分子在进化上的高度保守性,提示了其可能在生命功能的诸多方面发挥重要功能。据推测,存在于人体内的超过1000种的miRNA可以调控近三分之一编码蛋白基因的表达,影响着几乎所有的信号通路。因此,肝癌中抑癌miRNA分子广泛下调的直接结果便是导致大量能促进肝癌发生发展的癌基因被活化。值得思考的是,目前的研究大多热衷于挖掘肿瘤与正常组织中差异表达的miRNA,进而研究其功能,却忽视了探寻导致这些miRNA异常表达的原因。如果能阐明肝癌中抑癌miRNA广泛下调的具体机理,将其作为靶点来逆转,那么将会为肝癌的临床治疗提供一种全新的有力武器。 癌基因EZH2在多种肿瘤的恶性进展中发挥了极为关键的作用。研究显示,EZH2不仅能沉默许多抑癌基因的表达,甚至在miRNA分子下调的过程中也扮演了重要角色。然而,关于EZH2是通过何种机制来特异性沉默抑癌基因的目前仍不清楚。在肝癌中EZH2是否会和一些致癌性转录因子相互协作来控制抑癌miRNA的表达?在这个过程中具体有哪些关键的miRNA受到了影响?它们发挥的作用又是什么?这些问题目前都尚不清楚,本课题将就此展开研究。 【目的】 鉴定肝癌细胞中与EZH2相互作用的致癌性转录因子,并筛选出同时受EZH2和该转录因子抑制的抑癌miRNA分子,进而探讨这些miRNA发生沉默的具体表观遗传学机制及其在肝癌发生发展过程中的作用与功能,为肝癌的预防、早期诊断以及治疗靶点的选择提供新的理论依据。 【方法】 1.通过串联质谱技术对肝癌细胞HepG2中EZH2相关复合物的组分进行分析,找到与之相互作用的致癌性转录因子;2.用免疫共沉淀实验对c-Myc与EZH2蛋白的相互作用进行验证,并分析c-Myc与EZH2蛋白结合所需的关键结构域;3.通过miRNA芯片技术分析c-Myc或EZH2下调后HepG2细胞的miRNA表达谱,筛选出同时受这两种基因抑制的miRNA分子,用qRT-PCR对芯片结果进行验证;4.采用表观遗传学药物5-Aza-CdR和TSA对肝癌细胞系(HepG2与SMMC-7721)进行处理,用qRT-PCR分析表观遗传调控对miR-101表达的影响;5.通过5’-RACE的方法确定miR-101前体的转录起始位点(TSS),并运用重亚硫酸盐直接测序技术分析miR-101启动子区DNA的甲基化修饰水平;6.采用针对EZH2酶活性的小分子抑制剂DZNep或特异性靶向c-Myc/EZH2的siRNA对肝癌细胞HepG2进行处理,用qRT-PCR分析c-Myc以及EZH2酶活性对miR-101(前体及成熟形式)表达的影响;7.通过染色质免疫沉淀联合qRT-PCR(ChIP-qPCR)的方法检测c-Myc以及PRC2各组分在miR-101启动子区的结合情况;8.利用荧光素酶报告基因实验分析c-Myc和EZH2对miR-101启动子活性的影响;9.通过软琼脂克隆形成实验、Transwell细胞侵袭实验、内皮细胞血管新生实验以及裸鼠皮下荷瘤实验分析miR-101对肝癌细胞多种恶性表型的影响;10.联合运用多种生物信息学软件对miR-101潜在的靶基因进行预测,并将预测的靶基因用DAVID数据库进行功能聚类分析;11.利用荧光素酶报告基因实验鉴定miR-101直接调控的靶基因,并用Western Blot实验在蛋白水平上进行验证;12.利用软琼脂克隆形成实验、Transwell细胞迁移实验、血管内皮细胞生长因子ELISA以及内皮细胞血管新生实验分析miR-101是否通过调控下游靶基因STMN1、CXCR7和JUNB来影响肝癌细胞的恶性表型;13.采用成熟形式miR-101的mimics对肝癌细胞HepG2进行转染,通过qRT-PCR检测miR-101前体水平的改变来观察外源性miR-101对其内源性表达的影响;14.通过miRNA原位杂交和免疫组织化学的方法分析裸鼠荷瘤组织与肝癌临床样品组织中miR-101、c-Myc、EZH2、EED、JUNB、STMN1及CXCR7的表达情况,并用qRT-PCR和Western Blot实验检测这些分子在3例正常肝组织与7例肝癌组织中的表达水平,分析miR-101和这些基因的临床相关性;15.通过qRT-PCR和免疫组织化学的方法对包含54例肝癌临床样品的组织芯片进行检测,分析c-Myc和EZH2异常表达对miR-101水平的影响,并采用c-Myc与EZH2双分子联合对这群肝癌病人的预后进行分析。 【结果】 1.质谱分析的结果显示,在肝癌细胞HepG2中,EZH2相关复合物中不仅包含了PRC2的其他组分,而且还含有一个重要的致癌性转录因子c-Myc;2.免疫共沉淀实验证实c-Myc与EZH2确实能够发生相互作用,并且这种作用依赖于c-Myc蛋白的MBII和bHLH-LZ结构域;3. miRNA芯片结果显示,miR-101等10种miRNA在肝癌细胞HepG2中同时受到c-Myc和EZH2的抑制,qRT-PCR证实在干涉c-Myc或EZH2后miR-101的表达确实发生上调,鉴于miR-101在正常肝组织中的高丰度和在肝癌组织中的低表达,选择miR-101进行深入研究;4. qRT-PCR结果显示,联合使用表观遗传学药物5-Aza-CdR和TSA对肝癌细胞系(HepG2与SMMC-7721)进行刺激能显著上调其miR-101的表达水平,而单独使用则对miR-101的表达无明显影响;5.5’-RACE的结果显示,miR-101-1的TSS位于其成熟序列上游9.3kb的地方,并且在其原始转录本形成的过程中发生了剪接,而miR-101-2的TSS则紧邻其成熟序列,进一步的重亚硫酸盐测序发现,肝癌细胞中miR-101启动子区并未发生显著的高甲基化;6. qRT-PCR结果显示,干涉c-Myc或EZH2后,肝癌细胞HepG2中miR-101前体的水平会显著上升,而用DZNep抑制EZH2酶活性之后也能有效上调前体及成熟形式miR-101的表达;7. ChIP-qPCR结果显示,c-Myc、EZH2和EED在miR-101启动子区有特异的结合信号且结合模式非常相似,同时该区域也能检测到较强的H3K27me3修饰信号;8.荧光素酶报告基因实验显示,c-Myc和EZH2能够协同发挥作用来抑制miR-101启动子的活性;9.体内及体外的功能研究表明,miR-101能显著抑制肝癌细胞的非锚定依赖性生长能力、转移侵袭能力、促血管新生能力以及成瘤能力;10.生物信息学预测提示,miR-101可能通过抑制下游的EZH2、EED、JUNB、STMN1、CXCR7等基因来影响染色质重塑、血管新生、细胞生长及迁移等过程;11.荧光素酶报告基因与Western Blot实验证实,EZH2、EED、JUNB、STMN1和CXCR7确实是miR-101直接调控的下游靶基因;12.进一步的体内及体外功能研究表明,miR-101可通过抑制这些下游靶分子来逆转肝癌细胞多种相关恶性表型;13. qRT-PCR结果显示,只需瞬时转染一次外源性miR-101就能显著并持久地提升肝癌细胞中内源性miR-101前体的表达;14. miRNA原位杂交及免疫组织化学的结果显示,在裸鼠荷瘤组织与肝癌临床样品组织中miR-101的表达缺失,而c-Myc、EZH2、EED、JUNB、STMN1、CXCR7则是异常高表达,进一步对3例正常肝组织及7例肝癌组织的分析发现,miR-101与这些分子的表达水平呈显著负相关;15.肝癌组织芯片的分析结果显示,c-Myc和EZH2同时高表达的肝癌组织中miR-101水平最低且患者的预后最差,而c-Myc和EZH2都不表达的肝癌组织中miR-101水平则相对较高并且患者的预后也最好。 【结论】 1.在肝癌细胞中,癌基因c-Myc首先结合到miR-101的启动子区并募集以EZH2为核心的PRC2复合物,进而催化组蛋白发生H3K27me3的修饰,最终导致miR-101的表观遗传学沉默;2. miR-101可逆转肝癌细胞诸多的恶性表型,其可能的分子机制是:miR-101通过负性调控下游靶基因STMN1、CXCR7和JUNB的表达来控制细胞的增殖、转移、血管新生等过程;3. miR-101还能负性调控PRC2复合物中的两个组分——EZH2和EED,从而在miR-101与PRC2之间形成一个双负反馈环路,该环路的失衡是导致肝癌细胞中miR-101完全沉默以及下游信号通路出现异常的关键原因。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R735.7

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