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《第四军医大学》 2013年
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胃癌血管生成分子探针的构建及活体MR成像研究

徐健  
【摘要】:【背景】 绝大多数恶性实体肿瘤都具有血管依赖性。在其生长、转移的过程中,新生血管生成起着至关重要的作用。在肿瘤微环境的影响下,肿瘤血管在形态、功能、蛋白表达、对细胞因子的反应性,以及在遗传学水平上与正常血管存在差异。以解剖学为基础的传统影像模式在肿瘤的早期诊断及疗效评价方面已难有大的突破。分子影像学的研究方法以其无创、实时、可重复性的优点在肿瘤血管生成研究领域展现了巨大的潜力,有望从血管生成的角度提高对实体瘤诊断、分期的敏感性和特异性,并为抗血管生成治疗的疗效评价提供客观依据。本课题以胃癌血管内皮细胞特异性结合肽(GEBP11)为基础,首次构建了针对胃癌血管内皮细胞的靶向MR对比剂,研究其制备,生物学活性,与胃癌血管内皮细胞结合的特异性及毒性等,并研究了在临床常用的1.5T及3.0T场强核磁共振条件下标记后细胞体外成像和荷瘤裸鼠活体内成像评价肿瘤血管生成的可行性。 【目的】 1、探讨以Fe_3O_4纳米颗粒和GEBP11为基础合成胃癌血管内皮细胞靶向MR探针的可行性并鉴定探针改变MR信号的能力、安全性及特异性; 2、通过体外实验证实该探针可用于标记胃癌血管内皮细胞并能进行MR成像; 3、通过荷人胃癌裸鼠模型的MR成像研究进一步探讨该探针评价胃癌血管生成的可行性。 【方法】 1、以Fe_3O_4纳米颗粒和GEBP11为基础,构建特异性MR探针,首次针对胃癌血管内皮细胞进行靶向性的MR成像。用溶胶凝胶法合成Fe_3O_4纳米晶体,测定其改变MR信号的能力,明胶包裹后通过交联剂使Fe_3O_4纳米晶体与GEBP11结合,构建胃癌血管内皮细胞特异性MR探针——GEBP11@Fe_3O_4,测定固定化效率,并对小鼠进行体内急性毒性试验,初步了解该探针的急性毒性;构建FITC标记的短肽及其与Fe_3O_4纳米颗粒的偶联物,用于细胞结合特异性实验研究。2、建立了人脐静脉内皮细胞与人胃腺癌SGC7901细胞体外共培养的模型,鉴定其生物学活性,利用MTT法测定不同浓度GEBP11@Fe_3O_4探针对体外培养的内皮细胞的毒性。3、以无关短肽URP作对照,采用免疫荧光技术、透射电镜鉴定GEBP11@Fe_3O_4MR探针与胃癌血管结合的特异性。4、研究GEBP11@Fe_3O_4MR探针用于胃癌血管内皮细胞特异性体外成像的可行性,建立不同的MR扫描序列,观察不同浓度探针标记后细胞的体外MR成像情况,探讨合理的标记浓度和最敏感的成像序列;5、建立荷胃癌裸鼠模型,经尾静脉注射GEBP11@Fe_3O_4,观察其对裸鼠组织器官及肿瘤MR信号的影响,探讨其用于活体内成像评价肿瘤血管生成的可行性。 【结果】 1、溶胶凝胶法成功合成Fe_3O_4纳米颗粒,电镜检测其粒径约20nm,明胶包裹并偶联GEBP11后,电镜检测其粒径约50nm。探针溶液MR扫描在T2*WI及T2WI序列可明显降低图像信号,在T1WI序列图像信号无明显改变,统计学检验证实了其灰度值的差异。急性毒性试验显示,注射GEBP11@Fe_3O_4小于0.5mg/只未见对小鼠有明显影响,该剂量是安全的,1mg/只的剂量组3只实验动物死亡; 2、建立了人脐静脉内皮细胞与人胃腺癌SGC7901细胞体外共培养的模型,通过免疫组化实验、生长状态观察、粘附能力比较及细胞增殖实验,证实共培养内皮细胞具有和胃癌血管内皮细胞相似的生物学特征;四甲基偶氮唑兰(MTT)比色法检测细胞的增殖能力,得出细胞生长曲线图,证实用50μg Fe/ml浓度的GEBP11@Fe_3O_4标记的细胞,具有与未标记细胞近似的增殖能力。 3、免疫荧光染色结果显示,孵育约30min至1h,可见细胞内绿色荧光,无关肽组未见绿色荧光显示;TEM结果可见探针标记后的细胞内多数致密电子密度颗粒。 4、体外MR成像可见用50μg Fe/ml浓度的GEBP11@Fe_3O_4标记后的内皮细胞在细胞浓度大于1.0×105/ml时可改变MR T2*序列的图像信号。 5、荷胃癌裸鼠MR显像结果,静脉注射GEBP11@Fe_3O_4后30min,实验组荷胃癌裸鼠肿瘤组织T2*WI信号较无关肽组肿瘤组织略有降低,提示GEBP11@Fe_3O_4有望成为检测胃癌血管生成的特异性MR探针。 【结论】 1、溶胶凝胶法制备的Fe_3O_4纳米颗粒明胶包裹后粒径约50nm,具有良好的顺磁性,偶联GEBP11构建的胃癌血管内皮细胞靶向MR探针具有改变MR信号的能力。 2、通过免疫荧光技术及标记后细胞的体外成像实验证实,该探针可以与胃癌血管内皮细胞特异结合,并可明显降低T2*WI序列MR信号。 3、活体实验证实GEBP11@Fe_3O_4MR探针可改变荷胃癌裸鼠瘤体的T2*WI序列MR信号,为活体观察胃癌的血管生成并动态评价抗血管生成的疗效奠定基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2013
【分类号】:R445.2;R735.2

【共引文献】
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