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TRP通道在糖尿病机械性痛中的作用机理

崔媛媛  
【摘要】:【背景及目的】 糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种临床上常见的内分泌代谢紊乱性疾病,由于长期的高血糖状态常常会导致周围神经发生病理性改变而表现出明显的糖尿病神经病理性痛(diabetic neuropathic pain,DNP)。DNP是DM患者危害最为严重的并发症之一,部分患者在受到机械刺激时会出现显著的异常疼痛,称之为糖尿病机械性痛(diabetic mechanical allodynia,DMA),DMA严重影响了患者的生活质量。然而由于对DMA发生发展的分子机制尚无全面认识,目前仍缺乏针对其有效的治疗措施。因此,本研究以链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)制备的DMA模型大鼠为基础,采用分子生物学、形态学和行为药理学等方法,在疼痛信号的“起搏器”背根神经节(dorsal root ganglia,DRG)和脊髓水平,研究机械性敏感的TRP通道TRPV1、TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1随DMA发生发展的时空表达变化,并在此基础上进一步探讨其拮抗剂对DMA的镇痛效应。实验旨在揭示DMA发病的分子机理,为临床治疗提供新思路和实验依据。 【方法】 (1)建立DM大鼠模型;(2)应用von Frey丝测定DM模型大鼠机械性后爪回缩阈值(paw withdrawal threshold,PWT)的变化,筛选DMA模型大鼠;(3)应用Hargreaves热辐射法测定DM模型大鼠热刺激后爪回缩潜伏期(paw withdrawallatency,PWL)的变化,筛选DM热痛模型大鼠;(4)运用实时定量PCR方法检测DMA模型大鼠DRG中TRPV1的mRNA表达变化;(5)运用Western blot方法检测DMA模型大鼠DRG和脊髓背角的TRPV1蛋白表达变化;(6)运用免疫荧光染色方法观察DMA模型大鼠DRG和脊髓背角中TRPV1的表达变化;(7)运用免疫荧光双重染色观察DMA模型大鼠DRG中TRPV1与NF200、CGRP和IB4双标细胞的比例变化;(8)DMA模型大鼠鞘内置管,在DMA14d单次注射不同剂量的RR或CPZ,测定给药后不同时间点模型大鼠的PWT,并计算RR的半数有效剂量(ED50);(9)DMA模型大鼠鞘内置管,从DMA14d至20d连续注射不同剂量的RR或CPZ,测定大鼠PWT;(10)运用实时定量PCR方法检测DMA模型大鼠DRG中TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1的mRNA表达变化;(11)运用Western blot方法检测DMA模型大鼠DRG和脊髓背角中TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1蛋白质的表达变化;(12)运用免疫荧光染色方法观察DMA模型大鼠DRG和脊髓背角中TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1的表达变化;(13)运用免疫荧光双重染色观察DMA模型大鼠DRG中TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1与NF200、CGRP和IB4双标细胞的比例变化;(14)DMA模型大鼠鞘内置管,在DMA7d单次注射不同剂量的SKF96365,分别测定给药后不同时间点大鼠的PWT,并计算SKF96365的ED50;(15)根据RR和SKF96365的ED50,计算联合用药剂量并鞘内注射给药,测定给药后不同时间点大鼠的PWT(;16)运用PCR方法检测无机械痛有热痛的DM模型大鼠DRG中TRPV1、TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1的mRNA表达变化;(17)无机械痛有热痛的DM模型大鼠鞘内置管,在DMA14d分别给予ED50剂量的RR和SKF96365,测定不同药物在注射后不同时间点大鼠的PWL。 【结果】 (1)在DM模型大鼠造模后3d观察到血糖水平显著升高,体重增长明显缓慢;(2)造模后7d,约50%的DM模型大鼠双侧后爪出现明显的机械性触诱发痛(diabeticmechanical allodynia,DMA;8g,DMA模型大鼠);(3)造模后7d,约90%的DM模型大鼠出现明显的PWL延长(8s)(;4)DMA模型大鼠DRG中TRPV1mRNA的表达在DMA7d和14d明显增多;(5)DMA状态下,DRG和脊髓背角中TRPV1蛋白分别在14d和7d开始上调,二者不完全匹配;(6)免疫荧光染色结果显示,DMA14d组模型大鼠DRG的TRPV1阳性细胞和脊髓背角的TRPV1阳性终末均明显增多,且在DRG中TRPV1阳性细胞的大小比率随DMA进程发生改变;(7)双重免疫荧光标记显示,DMA模型大鼠DRG中增多的TRPV1阳性细胞主要是CGRP阳性的肽能神经元;(8)鞘内单次注射RR或CPZ均具有明显的剂量依赖性镇痛作用,RR的镇痛作用出现较晚(4h),但维持时间长,而CPZ则相反;(9)鞘内连续注射RR或CPZ均能显著上调DMA模型大鼠降低的机械性痛阈值,镇痛效应呈剂量依赖性,且RR比CPZ的累积效应更明显;(10)DMA模型大鼠DRG中其他机械敏感性TRP通道的mRNA表达上调时间不同:TRPV4在DMA14d,TRPC1在DMA28d,TRPC6在DMA7d,而TRPA1在DMA21d和28d;(11)在DMA模型大鼠的DRG和脊髓背角中,除TRPC1的蛋白质显著增多的时间比其mRNA的变化晚1w外,其余3种TRP通道的蛋白质表达与其各自mRNA的变化时程基本一致;(12)免疫荧光染色结果表明这四种蛋白在细胞内的分布模式不尽相同,TRPC6和TRPA1呈均匀分布,而TRPC1和TRPV4呈局域化分布;此外,DMA状态下增多的TRP蛋白有在较大直径细胞中分布增多的趋势;(13)免疫荧光双重染色显示,在DMA模型大鼠中增多的TRP阳性神经元的性质不同:TRPV4和TRPA1主要为CGRP阳性的肽能神经元,TRPC1是NF200阳性的大型神经元,而TRPC6则是IB4阳性的非肽能神经元;(14)鞘内单次注射SKF96365具有剂量依赖性的镇痛作用,其镇痛作用出现较快(2h),但维持时间短;(15)鞘内联合注射RR和SKF96365能显著缓解DMA模型大鼠的机械性痛行为,具有起效早,维持时间长的协同作用;(16)在无机械痛仅有热痛的DM模型大鼠DRG中TRPV1和TRPV4的mRNA表达明显上调,而TRPC1、TRPC6和TRPA1则没有明显变化;(17)对仅有热痛的DM模型大鼠鞘内注射RR或SKF96365,只有RR能缓解热痛敏,而SKF96365却无效。 【结论】 (1)DNP模型大鼠的机械性痛和热痛并不匹配,约50%的DM模型大鼠兼具机械痛和热痛,而90%左右的DM模型大鼠具有热痛,尚有约10%的大鼠处于无痛状态。因此针对此模型的相关研究,尤其是进行基因表达研究时一定要注意疼痛形式的甄别和严格动物分组,以免结果偏差。 (2)DMA模型大鼠DRG和脊髓背角的TRPV1表达在DMA14d显著增多,且机械性痛敏能被其拮抗剂RR和CPZ抑制,提示TRPV1是与机械性痛的发生发展有关的重要分子。 (3)DMA模型大鼠DRG和脊髓背角的TRPV4、TRPC1、TRPC6和TRPA1表达在DMA的不同时程点均呈现增高趋势,且非特异性拮抗剂RR和SKF96365能显著抑制DMA模型大鼠的机械性痛行为,提示糖尿病机械性痛的产生和维持是一个复杂的过程,五种TRP通道在不同阶段参与DMA的发展:TRPC6在观察范围内的早期阶段、TRPV1和TRPV4在中期、TRPC1和TRPA1在晚期发挥作用。因此,在DRG中DM的机械痛产生如热痛一样具有感受机械性刺激的分子谱系。 (4)与DMA的TRP通道机制不同,在仅出现热痛的糖尿病动物DRG中,TRPV1和TRPV4的表达明显上调,而TRPC1、TRPC6和TRPA1的表达没有明显变化;鞘内给予RR能产生明显的镇痛效应,而SKF96365则没有效果。此结果提示,糖尿病热痛的外周分子机制和机械痛并不相同,因此针对特定疼痛形式、分子靶点以及疼痛时程的个性化治疗可能是挑战DNP治疗瓶颈的重要策略。


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