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《第四军医大学》 2015年
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双链核糖核酸(dsRNA)的产生及其调控的信号通路在急性肺损伤发生发展中的分子机制研究

孙建斌  
【摘要】:目的:Alu RNA是人类基因组中SINE家族的最主要成员,B型RNA是与Alu RNA同源的小鼠SINE。近年来越来越多的研究显示非编码RNA与基因表达调控相关,与疾病相关。但Alu序列约占人类基因组的10%,一直以来被认为是“垃圾”序列,所以,Alu RNA的产生及其在疾病发生发展中的作用尚未阐明。急性肺损伤(acute lung injury,ALI)病死率高,脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)则是其主要致病物质。近年来,研究发现LPS等损伤性因素造成“呼吸爆发”导致的氧化应激在ALI的病理发展过程中扮演重要的角色。有研究提示氧化应激可诱导Alu RNA的产生,但ALI过程中Alu RNA的产生及其调控的分子机制尚未阐明。本课题将通过建立小鼠ALI模型,探讨Alu RNA同源分子B型RNA如何参与急性肺损伤的发生发展及其分子机制,为急性肺损伤的发病机制研究提供新的理论基础。方法和材料:本课题借助LPS诱导BALB/c小鼠ALI模型,利用分子克隆技术、原代细胞培养技术、激光共聚焦技术、免疫组化技术、Real-Time PCR技术、Western blot技术、酶联免疫吸附试验、细胞转染技术和MTS实验分别在体外和体内探讨B型RNA参与急性肺损伤引起炎症反应的过程,揭示B1 RNA激活NLRP3炎性小体及炎症因子表达的机制。实验结果:第一部分:LPS诱导小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞产生B型RNA来源的双链RNA首先我们通过双氧水刺激A549细胞建立氧化应激模型,使用特异性识别双链RNA的抗体与提取的H2O2刺激的A549细胞总RNA进行斑点杂交,结果证实双氧水刺激的A549细胞内含有ds RNA,而这种ds RNA被证实是Alu RNA。然后我们利用可导致氧化应激反应的脂多糖LPS诱导人肺腺癌A549细胞,观察LPS刺激过程中,是否也有Alu RNA的表达,结果证实LPS诱导的人A549细胞模型中Alu RNA的表达增加。在此基础上,我们使用磁珠分选的方法分离获得小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,利用流式细胞技术鉴定了分离的原代Ⅱ型肺泡上皮细胞的纯度;使用LPS作用于细胞,建立原代Ⅱ型肺泡上皮细胞的ALI模型;LPS刺激24h后收取细胞,通过RNA免疫沉淀技术(RNA Binding Protein Immuno-precipitation,RIP)捕获了细胞内的ds RNA,利用T-A克隆的方法构建了细胞内ds RNA的c DNA文库,并通过基因测序技术证实了ds RNA主要为B1 RNA。第二部分:LPS诱导小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞B型RNA的表达和调控信号通路重要分子的活化首先,通过q RT-PCR法检测了LPS诱导的小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中B1、B2及B4 RNA的表达水平,我们证实LPS诱导Ⅱ型肺泡上皮细胞中B1和B2 RNA表达增加。其次,发现LPS诱导的原代Ⅱ型肺泡上皮细胞中NLRP3炎性信号通路活化。通过q RT-PCR法检测了LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞中NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的转录水平,结果显示LPS诱导的Ⅱ型肺泡上皮细胞中NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的转录增加,ELISA实验证实了IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌水平也明显增加。接下来,我们发现磷酸化的NF-κB介导了B1 RNA诱导的NLRP3信号通路的活化。Western blot和q RT-PCR实验显示LPS应激后Ⅱ型肺泡上皮细胞中不仅NLRP3及其下游细胞因子被上调,NF-κB亦被磷酸化激活;为了鉴定NF-κB磷酸化与ds RNA的相关性,应用激光共聚焦实验揭示了ds RNA表达增高,分布于细胞核及核周,并与磷酸化的NF-κB具有共定位关系,强烈提示NF-κB参与了NLRP3炎性通路的活化;通过在LPS诱导的原代Ⅱ型肺泡上皮细胞中使用NF-κB磷酸化特异性抑制剂PDTC,q RT-PCR和ELISA实验发现其显著抑制了IL-1β、IL-18和TNF-α的转录和分泌;接下来,我们克隆并构建了B1 RNA的真核表达载体,转染pc DNA3.1-B1进入原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,实验证实,B1 RNA的转染和过表达可显著增加NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的转录和翻译,但该现象可被PDTC所抑制。最后我们利用MTS法检测了原代Ⅱ型肺泡上皮细胞转染B1 RNA后的细胞活力变化,结果显示LPS处理和B1 RNA的转染都能够降低原代Ⅱ型肺泡上皮细胞的活力,相应地,这种抑制作用能够被PDTC所改善。第三部分:体内实验研究LPS诱导B型RNA的产生及其调控的信号通路在急性肺损伤发生发展中的分子机制我们通过气管灌注的方法建立LPS诱导的小鼠急性肺损伤动物模型,并分离小鼠原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,与体外实验一致的是,q RT-PCR法证实了Ⅱ型肺泡上皮细胞中B1和B2的表达增加,Western blot实验证实了NF-κB的磷酸化水平及NLRP3表达增加,ELISA实验证实了IL-1β、IL-18和TNF-α的分泌增加。并利用免疫组化实验证实了LPS处理后小鼠肺组织中NF-κB磷酸化,NLRP3的表达及ds RNA的增加。结论:通过本课题研究,我们初步证实在LPS应激作用下,A549和小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中可产生Alu RNA来源的ds RNA。在小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中,这些双链RNA以B1 RNA为主。小鼠体外和体内实验证实B1 RNA转录增加可上调NLRP3、IL-1β、IL-18和TNF-α的表达。进一步通过检测NF-κB磷酸化水平证实,B1 RNA可通过调节NF-κB磷酸化介导NLRP3以及促炎因子的表达,在LPS诱导的小鼠ALI的炎症发生发展过程中起到重要的调控作用。不仅揭示了B1 RNA激活NLRP3炎性小体及炎症因子表达的机制,同时,为急性肺损伤的发病机制研究提供了新的理论基础。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R563

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