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《第四军医大学》 2016年
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Perilipin 5调控肝脏脂滴代谢的分子机制研究

王超  
【摘要】:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是代谢综合征(metabolic syndrome,MS)等疾病在肝脏的重要表现形式,其主要病理特征是弥漫性肝细胞脂肪变性。目前研究认为,尽管脂质过度沉积与NAFLD的发生发展密切相关,但肝细胞内的中性脂质并不是诱发非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)的直接原因,NASH发生的核心是肝细胞内过量的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)代谢所导致的脂毒性。过量的FFA在肝细胞中主要以甘油三酯(triglyceride,TG)的形式储存在脂滴(lipid droplets,LDs)中。因此,脂滴代谢异常与肝脏脂毒性损伤密切相关。脂滴以前被认为仅仅是一个细胞内储存中性脂质的结构,但目前大量研究认为,脂滴也是一个代谢活跃的多功能细胞器,在细胞的脂质储积、能量供应、膜结构形成、病毒复制和蛋白降解等过程中发挥着重要作用。脂滴主要由三部分组成,包括中性脂质的核心,覆盖于其表面的单层磷脂以及镶嵌在磷脂层上的脂滴蛋白(lipid droplet-associated proteins,LDPs)。其中,Perilipin家族是一组重要的脂滴蛋白,在调控脂滴代谢和维持细胞内脂质平衡中发挥着重要的作用。作为Perilipin家族的最新成员,Perilipin 5(Plin5)主要表达于高氧化代谢的组织中,如肝脏、心脏、骨骼肌和褐色脂肪组织(brownadiposetissue,bat)等。目前已有多项研究对plin5在心脏和骨骼肌中的作用进行了深入研究,我们也利用基因敲除小鼠,初步研究了plin5在肝脏中的作用,发现plin5敲除小鼠繁殖能力正常,体重、血糖、血脂、胰岛素敏感性等均未见明显异常,但肝脏中脂肪含量降低,并出现肝脏损伤的表现。然而,plin5缺失对小鼠肝脏脂肪代谢的具体影响和作用机制仍有待深入研究。本研究首先利用人肝脏石蜡标本和脂肪肝模型小鼠,确定了plin5表达水平与脂肪肝之间的关系;利用plin5敲除小鼠模型及体外过表达系统,进一步确定了plin5缺失对肝脏形态和脂肪代谢的影响,并阐明了plin5调控肝脏脂滴脂解的分子机制;最后,我们研究了plin5和cideb的相互作用以及二者对肝脏脂滴形态的影响。1)plin5在脂肪肝中表达水平升高plin5主要分布在肝小叶中央静脉周围,此部位是代谢相关肝脏脂肪变的常见区域。利用免疫组化,我们发现plin5在单纯性脂肪肝和nash患者肝脏中表达水平升高,其表达水平与nafld的发展密切相关。在ob/ob肥胖小鼠、高脂饮食(high-fatdiet,hfd)或饥饿诱导小鼠的脂肪肝组织中,plin5的表达水平均明显升高,进一步说明plin5表达水平与脂肪肝发生密切相关。尽管在脂肪肝中plin2的表达水平也明显升高,但我们发现,在饥饿诱导的小鼠脂肪肝的脂滴中,plin5的升高水平明显高于plin2,提示plin5在肝脏脂滴累积过程中扮演十分重要的角色。2)plin5缺失导致小鼠肝脏脂毒性损伤为了明确plin5在肝脏脂肪代谢中的具体作用,我们利用plin5敲除小鼠和原代肝细胞,分析了plin5缺失后小鼠肝脏氧化应激、内质网应激、炎症反应、纤维化以及线粒体功能等的变化情况。结果显示,plin5缺失导致小鼠肝细胞的脂解速率明显加快,细胞内ffa水平明显升高,血清中酮体含量也明显升高。同时,plin5缺失导致小鼠肝脏中活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)水平升高,肝脏出现脂质过氧化、氧化应激、内质网应激和明显的炎症反应,表明plin5缺失能够诱发肝脏脂毒性损伤。此外,plin5敲除小鼠肝脏中pparα被激活,线粒体呼吸链复合体关键分子的表达水平升高,表明plin5缺失增强了线粒体的氧化磷酸化能力。这些结果表明,plin5缺失导致的肝细胞内ffa水平升高,激活了pparα,并加速肝细胞中ffa的氧化分解,以减轻肝细胞内ffa过多导致的肝脏脂毒性损伤。3)plin5通过与cgi-58相互作用,抑制atgl的脂解活性为了确定plin5调控肝细胞脂滴脂解的分子机制,我们首先检测了plin5敲除小鼠肝脏中perilipin家族蛋白以及脂质合成和分解关键分子的表达情况。结果显示,plin5缺失能够降低肝脏中plin2的表达水平,但未影响plin3的表达。同时,plin5敲除小鼠肝脏中调控ffa合成的关键酶fas和acc的表达降低,但调控tg合成的关键酶dgat2、脂解酶atgl及其共激活因子cgi-58的表达水平均未见明显变化。进一步研究我们发现,plin5能够与cgi-58相互作用,且plin5的212-382aa是与cgi-58相互作用的关键结构域。我们还发现,plin5与cgi-58的相互作用能够阻止后者与atgl的结合,而plin5缺失肝细胞的脂解速率加快,且在过表达atgl和cgi-58时加快更为显著。这些结果表明,在肝细胞中,plin5通过与cgi-58相互作用,阻断cgi-58与atgl的结合,从而抑制atgl的脂解活性。4)plin5能够与cideb相互作用,二者在脂滴形成过程中发挥着不同的作用除了脂解,脂滴的形成和转运等过程在细胞脂肪代谢中也具有重要作用。我们早期的研究显示,plin5与cideb之间可能存在相互作用,而cideb是肝脏中表达水平最高的cide家族成员,其在肝细胞脂滴形成过程中具有重要的作用。为了深入研究plin5和cideb在肝脏脂滴形成过程中的作用,我们首先利用基因敲除小鼠发现,cideb敲除小鼠肝脏中plin5的表达水平明显升高,在plin5敲除小鼠肝脏中cideb的表达水平也略有升高。plin2在plin5敲除小鼠肝脏中表达降低,而在cideb敲除小鼠肝脏中表达升高,这与敲除小鼠肝脏的脂肪含量正相关。plin5缺失导致肝细胞中脂肪含量降低,主要表现为脂滴数量明显减少,但过表达cideb并不能够增加plin5缺失肝细胞中的脂肪含量。然而,在cideb缺失肝细胞中过表达plin5能够明显增加脂滴的数量,但对脂滴大小没有明显影响,表现为更多小脂滴的储积。利用免疫荧光技术,我们确定了plin5和cideb在细胞中有共定位,且plin5和cideb能够相互作用,cideb的c端(118-219aa)是其与plin5相互作用的关键结构域。因此我们认为,不同于cideb的促脂滴融合作用,plin5能够增加肝细胞内脂滴的数量,表明plin5也参与了脂滴的形成过程,但是Plin5与Cideb的相互作用在肝脏脂滴形成过程中的具体作用仍有待深入研究。综上所述,Plin5的表达水平与NAFLD的发生发展密切相关,Plin5能够与ATGL的共激活因子CGI-58相互作用,抑制ATGL的活性,减少肝细胞内脂滴的脂解。Plin5缺失的肝细胞中,脂滴表面CGI-58与ATGL结合增加,ATGL脂解活性被激活,导致肝细胞中脂滴含量减少,FFA含量增加。肝细胞中升高的FFA激活PPARα,导致其下游一系列与脂肪代谢密切相关的分子的表达。同时线粒体增殖,氧化磷酸化能力增强,增加β氧化以清除细胞内过多的FFA。肝细胞内过多的FFA氧化导致ROS生成增加,进而出现脂质过氧化、氧化应激、内质网应激以及炎症反应,最终导致肝脏脂毒性损伤。在脂滴形成方面,Plin5和Cideb缺失能够相互促进彼此的表达,并且Plin5能够与Cideb相互作用。Plin5能够增加肝细胞中脂滴的数量,而Cideb能够促进脂滴的融合,二者共同参与肝细胞脂滴的形成过程。但是Plin5和Cideb的相互作用在肝脏脂滴形成过程中的具体作用仍有待深入研究。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R575.5

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