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《第四军医大学》 2016年
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RANTES受体在人附睾中的表达及功能研究

马斌芳  
【摘要】:目的附睾上皮不同类型细胞之间存在复杂的相互作用关系,共同维持管腔液的酸性环境,保持精子处于静息状态而避免其提前获能。我们的前期研究显示,受激活调正常T细胞表达和分泌因子(regulated upon activation,normal T cell expressed and secreted)RANTES主要表达于人附睾上皮的巨噬细胞。为进一步了解RANTES受体在人附睾的表达情况以及RANTES是否通过受体在附睾上皮细胞之间传递信号,本研究首先观察RANTES受体CCR1、CCR3、CCR5在人附睾的表达和定位,RANTES在大鼠附睾的细胞定位;然后建立大鼠附睾微灌注模型,探讨RANTES及其受体参与附睾管腔酸环境调节的作用机制。方法1.采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcriptpolymerase chain reaction,RT-PCR)、免疫组织化学和免疫荧光双标技术观察RANTES受体在人附睾中的表达及定位,采用免疫荧光双标技术观察RANTES在大鼠附睾上皮中的细胞定位。2.建立大鼠附睾在体微灌注模型,附睾尾部管腔分别灌注p H为6.8和7.8的PBS,作用30 min后取材,利用实时定量PCR和Western blot检测酸碱度变化对附睾尾部RANTES表达的影响;激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy CLSM)下观察不同酸碱环境下V-ATPase在附睾亮细胞上的分布情况。3.大鼠附睾尾部管腔灌注RANTES重组蛋白,作用30 min后取材,利用实时定量PCR、Western blot及CLSM技术检测RANTES对附睾尾部V-ATPase及i NOS表达的影响。4.大鼠附睾尾部管腔灌注RANTES竞争性受体拮抗剂Met-RANTES,作用30 min然后取材,利用实时定量PCR、Western-blot及CLSM技术检测Met-RANTES对附睾尾部V-ATPase及i NOS表达的影响。结果1.RT-PCR结果显示RANTES受体CCR1、CCR5在人附睾中有表达,CCR3无表达。免疫组化结果显示CCR1表达于附睾输出小管的纤毛细胞、附睾管的顶细胞和基底部细胞,CCR5在附睾上皮广泛表达。免疫荧光双标进一步证实在输出小管RANTES与CCR1共存于纤毛细胞,在附睾头、体、尾部主要共存于基底部细胞。RANTES与F4/80在大鼠附睾上皮巨噬细胞有共定位信号。2.大鼠附睾尾部灌注p H 7.8的PBS后,与对照组(p H 6.8)相比,实时定量PCR及Western blot结果显示RANTES表达升高,CLSM结果显示附睾上皮亮细胞顶部V-ATPase聚集增多。3.大鼠附睾尾部给予RANTES刺激后,与对照组(p H 6.8 PBS)相比,实时定量PCR和Western blot结果显示,实验组V-ATPase和i NOS表达升高,CLSM结果显示,附睾上皮巨噬细胞i NOS阳性信号增强,亮细胞顶部V-ATPase聚集增多。4.大鼠附睾尾部灌注Met-RANTES后,与RANTES刺激组相比,实时定量PCR和Western blot结果显示,Met-RANTES组V-ATPase和i NOS表达降低,CLSM结果显示Met-RANTES组附睾上皮巨噬细胞i NOS阳性信号减弱,亮细胞顶部V-ATPase聚集减少。结论1.CCR1、CCR5在人附睾有表达且与RANTES主要共定位于附睾上皮基底部细胞,CCR3无表达,提示RANTES可能通过受体CCR1和CCR5在附睾巨噬细胞起作用。本研究也证实了RANTES表达于大鼠附睾巨噬细胞。2.大鼠附睾尾部灌注碱性PBS后,RANTES表达增强,同时亮细胞顶部V-ATPase聚集增多,提示RANTES的表达与附睾管腔酸环境的改变有关。3.大鼠附睾尾部给予RANTES刺激后,巨噬细胞中i NOS的表达增强以及亮细胞顶部V-ATPase聚集增多,进一步说明RANTES通过巨噬细胞传递NO给亮细胞,参与附睾管腔酸性环境的调节。4.大鼠附睾尾部灌注Met-RANTES后,与RANTES刺激组相比V-ATPase和i NOS的表达减弱,提示RANTES是通过与受体结合促进巨噬细胞释放NO,从而协助维持附睾管腔酸性环境的平衡。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R339.21

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