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《第四军医大学》 2016年
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透明质酸复合骨替代材料促进成骨效果及机制研究

赵宁波  
【摘要】:颗粒状骨替代材料是目前种植领域最常使用的引导骨再生的植骨材料,但在临床应用时松散,易被血液、冲洗液冲散,在骨愈合过程中不能保持植骨区域的空间稳定性。水凝胶作为赋形剂,与骨替代材料复合将提供一种可行的解决方法。作为细胞外基质的重要组成部分的透明质酸(hyaluronic acid,HA)是常用的水凝胶,具有高度黏弹性、渗透性及良好的生物相容性。HA的粘度及对细胞的影响与其分子量和浓度相关。但是,HA的分子量和浓度对骨替代材料内聚性影响的客观评价缺乏,HA的分子量和浓度对细胞增殖和分化的影响仍存在争议,HA及其降解与成骨的关系尚不清楚。本研究拟通过探索HA的分子量和浓度对骨替代材料的内聚性、对细胞增殖和成骨分化影响的规律;筛选合适分子量和浓度的HA,观察HA-骨替代材料复合物的成骨效果;分析HA及其降解与复合物成骨的关系,旨在解决临床上颗粒状骨替代材料内聚性差这一问题,为进一步优化颗粒状骨替代材料的性状提供科学依据,对颗粒状骨替代材料新剂型的研发和临床转化提供思路。第一部分透明质酸的分子量和浓度对颗粒状骨替代材料内聚性的影响目的:研究HA的分子量和浓度对颗粒状骨替代材料Bio-Oss?内聚性、结构特点和物相组成的影响。方法:用电磁旋转粘度计测HA溶液(分子量分别为390、1110、1650、2090及2630 kDa,浓度分别为0.5、1和2 mg/mL)的粘度。1 mLHA溶液和900 mg Bio-Oss?复合,检测复合物的重量减少率。浓度均为2 mg/mL,分子量分别为390、1110、1650、2090及2630kda的ha溶液与bio-oss?按上述比例复合,扫描电镜(scanningelectronmicroscopic,sem)观察表面形态及超微结构,x射线衍射(x-raydiffraction,xrd)检测物相组成及晶体结构。单独bio-oss?为对照。结果:分子量和浓度均显著地影响ha溶液的粘度(p=0.00),且两影响因素之间存在交互效应(p=0.00)。浓度一定时,粘度随分子量的增大而增大。分子量一定时,粘度随浓度的增大而增大。分子量为2630kda,浓度为2mg/ml的ha溶液的粘度最大,为33500±450.69mpa.s。分子量和浓度对bio-oss?-ha复合物重量减少率的影响存在交互效应(p=0.00)。分子量显著地影响复合物的重量减少率(p=0.00),分子量越大复合物的重量减少率越小。分子量一定时,复合物的重量减少率随浓度的增大而减小,但不同浓度间无显著性差异(p0.05)。ha分子量为2630kda、浓度为2mg/ml时,复合物的重量减少率最小,为1.31±0.10%。sem图和xrd图表明不同分子量ha的加入未改变bio-oss?的结构特点、物相组成和晶体结构。结论:ha溶液的粘度随分子量和浓度的增大而增大;ha的加入增加了骨替代材料bio-oss?的内聚性,且对其微观结构特点、物相组成和晶体结构未产生明显影响,ha的分子量为2630kda、浓度为2mg/ml时,bio-oss?-ha复合物的内聚性最好。第二部分透明质酸的分子量和浓度对兔骨髓来源的间充质干细胞体外增殖和成骨分化的影响目的:研究ha的分子量和浓度对体外培养的兔骨髓来源的间充质干细胞(rabbitbonemarrow-derivedstemcells,rbmscs)的增殖和成骨分化的影响。方法:用不同分子量(分别为390、1110、1650、2090及2630kda)和浓度(分别为0.5、1和2mg/ml)的ha溶液修饰细胞培养板,检测rbmscs在不同培养板中的细胞粘附率、增殖和成骨分化情况。细胞粘附率用细胞计数器计数并计算;细胞增殖用cck-8(cellcountingkit-8,cck-8)试剂盒检测;通过茜素红染色,real-timert-pcr检测成骨标志性基因碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,alp)、runt相关转录因子2(runt-relatedtranscriptionfactor2,runx-2)和骨钙素(osteocalcin,ocn)mrna的相对表达量来表明rbmscs成骨分化情况。结果:ha的分子量和浓度均显著地影响细胞粘附率和增殖,且二者对细胞粘附率和增殖的影响存在交互效应(p0.05)。培养板经ha修饰后,随分子量的增加或浓度的降低,细胞粘附率降低(p0.05)。经分子量为390kda,浓度为0.5、1和2mg/ml;分子量为1110kda,浓度为1mg/ml的ha修饰过的培养板中的细胞增殖,分别显著地高于未修饰组的(p0.05)。经分子量为1110kda,浓度为2mg/ml;分子量为2090kda,浓度为1和2mg/ml;分子量为2630kda,浓度为0.5、1和2mg/ml的ha修饰过的培养板中的细胞增殖,分别低于未修饰组的,但均无统计学差异(p0.05)。随分子量的增加,矿化结节变多。经分子量为1650kda,浓度为2mg/ml;分子量为2090和2630kda,浓度为0.5、1和2mg/ml的ha修饰过的培养板中的alpmrna的表达,分别显著地高于未修饰组的(p0.05)。经分子量为1650kda,浓度为0.5和1mg/ml;分子量为2630kda,浓度为0.5、1和2mg/ml的ha修饰过的培养板中的runx-2mrna的表达,分别显著地高于未修饰组的(p0.05)。经分子量为2090kda,浓度为2mg/ml;分子量为2630kda,浓度为1和2mg/ml的ha修饰过的培养板中的ocnmrna的表达,分别显著地高于未修饰组的(p0.05)。alp、runx-2和ocnmrna的表达具有分子量依赖性,分子量越高,mrna表达越高(p0.05)。结论:ha分子量越大,细胞粘附率越低。低分子量的ha提高了细胞增殖。高分子量的ha促进了矿化结节的形成,提高了成骨标志性基因的mrna的表达。第三部分bio-oss?-透明质酸复合物在大鼠颅骨极限骨缺损区成骨效果的研究目的:检测bio-oss?-ha复合物在大鼠颅骨极限骨缺损(criticalsizedefect,csd)区的成骨效果。方法:建立大鼠颅骨csd模型,选择分子量为2630kda、浓度为2mg/ml的ha与bio-oss?复合,分实验组、阴性对照组和空白对照组(分别植入bio-oss?-ha复合物、单独bio-oss?及无植入物)。术后第1、2、3、4及8周取材并大体观察csd区愈合情况,第2、4及8周行组织学检测,第8周行micro-ct扫描。结果:大体观察及he染色显示,随术后时间的延长,实验组新骨的形成早于并多于其他两组。micro-ct扫描发现,实验组csd区新生骨组织更多、更连续。每两两组间的bv/tv、tb.n及tb.pf均具有统计学差异(p0.05),实验组的bv/tv和tb.n均显著地高于其他两组的,而tb.pf显著地低于其他两组的。每两两组间的tb.th均无统计学差异(P0.05);对于Tb.Sp,实验组与空白对照组、阴性对照组与空白对照组间均具有统计学差异(P0.05),空白对照组的Tb.Sp显著地高于其他两组的,实验组与阴性对照组间无统计学差异(P0.05)。结论:分子量为2630 kDa、浓度为2 mg/mL的HA与Bio-Oss?组成的复合物显著地促进了大鼠颅骨CSD的愈合,主要表现为BV/TV、Tb.N增加及骨小梁的连接性更好。第四部分透明质酸及其降解与Bio-Oss?-透明质酸复合物成骨的关系目的:研究HA及其降解与Bio-Oss?-HA复合物促进成骨的机制。方法:动物模型及分组同第三部分。术后第1、2、3及4周用real-time RT-PCR检测Hyal1、Hyal2、BMP-2、RUNX-2和OCN基因mRNA的表达,用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测BMP-2、RUNX-2和OCN蛋白的表达。结果:术后第1和2周,3组中Hyal1、Hyal2的mRNA均为低表达,3组间无差异(P0.05)。术后第3和4周,实验组Hyal1、Hyal2 mRNA的表达均显著地高于其他两组的(P0.01)。随术后时间延长,3组中BMP-2 mRNA的表达呈“少-多-少”的变化趋势。RUNX-2 mRNA的表达在整个实验阶段均较高。术后第1周,3组中均有少量OCN mRNA的表达,但每两两组间的表达无显著性差异(P0.05),术后第2、3和4周,其表达均呈增加趋势,实验组的表达显著地高于其他两组的(P0.01)。IHC显示,同一时间点不同成骨标志蛋白的表达,实验组最强,阴性对照组次之,空白对照组最弱;不同时间点BMP-2的表达呈“少-多-少”的趋势,RUNX-2在整个实验过程中持续高表达,实验组OCN的表达较其他两组更早、更多。结论:外源性HA的降解主要发生在成骨晚期,可能机制是HA的主要受体CD44、RHAMM及TLR4等被激活,使HA产生受体介导的内吞作用,细胞可能通过诱导Hyal1和Hyal2的活性使高分子量的HA降解为低分子量的片段,通过刺激血管生成,进而促进了新生骨组织的形成。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2016
【分类号】:R783.6

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