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HPV-E6/E7相关转录调控因子与AEG-1启动子活性关系研究

代瑛  
【摘要】:宫颈癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一,发病率仅次于乳腺癌位居女性肿瘤第二位。其发病机制复杂,学术界普遍认为人乳头状瘤病毒(Human Papilloma Virus,H PV),尤其是高危型HPV(如16及18型)感染为宫颈癌发病的重要诱因,该病毒表达的E6/E7蛋白则被认为是宫颈癌发病的关键致病因子,但其发病过程所需关键效应分子及其作用机制尚未完全阐明。近年来研究显示,星形胶质细胞上调基因-1(Astro ccyte Eleva ted G ene-1,AEG-1)几乎在所有恶性肿瘤中均高表达,并且在恶性肿瘤的发生发展过程中发挥着信号转导“中继站”作用,但其在高危型HPV所表达的E6/E7蛋白致宫颈癌过程中的作用机制及意义未见报道。本课题组前期研究发现,在宫颈癌组织中AEG-1与E6/E7表达呈平行关系;阻断宫颈癌细胞中的E6/E7蛋白表达,AEG-1表达下降,过表达E6/E7蛋白则反之,由此推断AEG-1可能为E6/E7致癌的关键效应分子之一。本课题拟通过启动子转录活性分析技术对AEG-1基因5’端启动子区转录调控因子结合位点进行分析,筛选出与E6/E7作用具有关联意义的转录调控因子,分析其对AEG-1启动子的活性影响,为最终阐明E6/E7蛋白调控AEG-1表达的分子机制提供理论及实验依据。目的:本课题拟从启动子转录活性分析入手,利用增强绿色荧光蛋白(EGFP)及双荧光素酶报告系统对AEG-1启动子活性进行研究,并找到E6/E7蛋白调控AEG-1表达的关键作用因子,为阐明E6/E7蛋白调控AEG-1表达的分子机制提供理论及实验依据,并为最终寻找宫颈癌新的治疗靶点奠定基础。方法:(1)从人宫颈癌细胞系HeLa基因组DNA中扩增出全长AEG-1启动子基因序列,并构建检测启动子活性的绿色荧光蛋白表达重组载体pGL3-Basic/EGFP/AEG-1p及荧光素酶报告重组载体pGL3-Basic/LUC/AEG-1p,分别转染HeLa及ECV304细胞(人脐静脉内皮细胞,正常对照),检测AEG-1启动子活性,并用Stathmin启动子活性检测载体pGL3-Basic/EGFP/stap、pGL3-Basic/LUC/stap作为阳性对照(实验室前期获得的高活性肿瘤特异性启动子载体);(2)对AEG-1启动子上转录调控因子结合位点进行分析,并结合文献报道的与E6/E7作用具有关联意义的转录调控因子,筛选出c-Myc、SP1、NF-κB、E2F转录调控因子作为研究对象,首先通过RT-PCR及Western Blot检测方法,在本实验室前期获得的干涉了E6/E7表达的HPV阳性宫颈癌细胞HeLa中检测以上转录调控因子的表达,比较其与未干涉E6/E7表达的HeLa细胞有无明显差异,证实所筛选转录调控因子的表达与E6/E7作用相关;接着我们通过染色质免疫共沉淀试验,验证所筛选转录调控因子与AEG-1启动上相应位点的结合作用;再将AEG-1基因启动子截短为含有不同转录调控因子结合位点的片段,构建相应的启动子活性分析载体,检测并分析其活性;(3)通过转录调控因子结合位点突变实验,将不同截短型AEG-1启动子进行位点突变,并构建相应的启动子活性分析载体,检测启动子活性变化,分析并阐明对AEG-1启动子具有激活作用或抑制作用的转录调控因子及位点;(4)根据上述结果,针对激活AEG-1启动子的转录调控因子基因序列构建shRNA干涉载体,转染HeLa细胞得到稳定抑制型细胞表达株,再将AEG-1启动子活性检测重组载体pGL3-Basic/LUC/AEG-1p转染该细胞株,检测启动子活性,验证该转录调控因子的表达对AEG-1启动子的激活作用;同时,针对抑制AEG-1启动子的转录调控因子基因序列构建全长真核表达载体,转染HeLa细胞得到稳定过表达细胞株,再将AEG-1启动子活性检测重组载体pGL3-Basic/LUC/AEG-1p转染该细胞株,检测启动子活性,验证该转录调控因子的表达对AEG-1启动子的抑制作用。结果:(1)从人宫颈癌细胞系HeLa基因组DNA中扩增出全长AEG-1启动子基因序列,并成功构建了启动子活性检测重组载体,将其转染HeLa及ECV304细胞,荧光显微镜下观察,HeLa细胞中可见高强度绿色荧光蛋白的表达,而ECV304细胞中仅为痕量;(2)RT-PCR及Western Blot检测E6/E7干涉的HeLa细胞中各转录调控因子的表达,结果显示c-Myc、SP1的表达下调,同时NF-κB、E2F的表达上调;染色质免疫共沉淀试验结果表明,c-Myc、SP1、NF-κB、E2F均可以与AEG-1启动子上相应的转录调控因子结合位点结合;将AEG-1基因启动子截短为含有不同组合转录调控因子结合位点的片段并构建启动子活性检测载体,检测其活性,结果显示阴性对照pGL3-Basic/EGFP载体及截短型启动子AEG-1pa无活性,而其余截短型AEG-1启动子AEG-1pb、AEG-1pc、AEG-1pd具有高活性且无明显差异;(3)构建不同突变型AEG-1启动子活性分析载体并检测其活性,结果显示:转录调控因子c-Myc及SP1结合位点突变对AEG-1启动子活性无明显影响,而NF-кB结合位点突变导致启动子活性减弱,E2F结合位点突变引起启动子活性增强;(4)将重组载体pGL3-Basic/LUC/AEG-1p转染HeLa/shNF-κB细胞并检测AEG-1启动子活性,结果显示其活性减低;将重组载体pGL3-Basic/LUC/AEG-1p转染He La/pcE2F细胞并检测AEG-1启动子活性,结果显示其活性减低。结论:(1)AEG-1启动子为高活性肿瘤特异性启动子;(2)转录调控因子c-Myc、SP1、NF-κB、E2F的表达与E6/E7作用相关,且均可与AEG-1基因启动上相应的转录调控因子结合位点结合;分析结果发现具有活性的截短型启动子AEG-1pb、AEG-1pc、AEG-1pd均含有转录调控因子结合位点NF-κB、E2F,可以推断含有NF-κB、E2F结合位点的截短型AEG-1启动子序列AEG-1pd为影响AEG-1启动子活性的关键区域;(3)突变转录调控因子NF-кB结合位点序列后AEG-1启动子的活性下降,突变转录调控因子E2F结合位点序列后AEG-1启动子的活性增强;(4)转录调控因子NF-κB的表达对AEG-1启动子活性具有增强的作用,而E2F的表达则具有抑制的作用。综上所述,通过对E6/E7相关转录调控因子与AEG-1启动子活性关系研究证实,HPV-E6/E7可通过影响转录调控因子NF-κB、E2F的表达进而改变AEG-1启动子活性,最终影响AEG-1的表达水平导致宫颈癌的发生,为阐明E6/E7蛋白调控AEG-1表达的分子机制提供理论及实验依据,并为最终找到宫颈癌的治疗靶点奠定基础。


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