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《第四军医大学》 2017年
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Basigin-2参与小胶质细胞调控氧诱导视网膜病变新生血管的生成

尹婕  
【摘要】:【研究背景】早产儿视网膜病变(retinopathy of premature,ROP)是一种多发于早产儿和低体重婴儿的视网膜血管病变,是目前世界范围内的首要儿童致盲病因。高浓度氧疗阻断了早产儿尚未成熟的视网膜血管的正常发育进程,造成周边视网膜缺血缺氧,继而引发异常新生血管生成,导致视网膜出血、渗出及增殖。因此,缺氧诱发的异常血管增生是ROP病理发生的核心机制之一。视网膜新生血管的形成是机体应对缺氧环境的适应性反应,包括内皮细胞与多种细胞的交互作用,过程十分复杂,机制远未阐明。小胶质细胞是定居中枢神经系统(central nervous system,CNS)的组织巨噬细胞,参与免疫调节、组织发育、自身稳定及创伤修复过程。近来大量研究选用发育期的小鼠视网膜作为研究血管生成的模型,结果证实,视网膜小胶质细胞是血管生成的早期驱动力量。视网膜小胶质细胞与血管紧密相邻的解剖空间关系强烈提示,小胶质细胞在血管生成中的重要作用,但是其内在机制尚不清楚。此外,小胶质细胞具有很强的移动性,能感知生理及病理刺激,传递微环境的信号,迅速应对局部的趋化信号,通过分泌细胞因子及神经营养因子作用于周围神经及血管成分,完成细胞间的沟通。因此,小胶质细胞在ROP病变中极有可能传递局部的缺氧信号,产生适应性反应,促进视网膜新生血管生成。Basigin是一种高度糖基化的跨膜糖蛋白,因具有诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)生成的能力被命名为MMP诱导因子,简称EMMPRIN,也被称为CD147。Basigin具有多重生物功能,如免疫反应、基质降解及细胞移行。该分子尤其在肿瘤局部的缺氧环境下促进新生血管生成,从而加强肿瘤的侵袭和转移。它不仅具备蛋白酶诱导作用,促进MMP的生成,也能增加肿瘤及内皮细胞的可溶性血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor,VEGFR)2的分泌。在卵巢癌患者,Basigin可通过可溶性或者以外泌体形式分泌到微环境中,促进肿瘤血管生成。此外,有研究显示Basigin在单核-巨噬细胞的表达上调,增加其炎性活性。Basigin广泛参与缺氧条件下新生血管的生成,但在以缺氧为核心环节的ROP病变中,Basigin是否参与小胶质细胞与血管内皮细胞之间的交互作用还有待研究。【研究目的】探讨小胶质细胞通过Basigin-2调控缺氧相关的视网膜新生血管生成的作用及其机制,为拓展ROP等缺血缺氧性视网膜新生血管疾病的治疗提供实验依据。【研究方法】一、体内实验:Basigin参与小胶质细胞促进氧诱导视网膜病变(oxygen induced retinopathy,OIR)新生血管形成。(1)动物模型:建立小鼠OIR模型。(2)组织病理:制作冰冻切片和视网膜铺片,采用免疫组化及Basigin、IBA-1免疫双荧光染色,标记Basigin及小胶质细胞,观察两者在视网膜的表达及两者的共定位。(3)Western blot检测:测定OIR模型P12和P17,神经视网膜低氧诱导因子(hypoxia inducible factor-α,HIF-1α)和Basigin蛋白表达的变化。二、体外实验:小胶质细胞表达Basigin,增强视网膜脉络膜微血管内皮细胞血管生成能力。(1)细胞模型:应用小胶质细胞BV2细胞系,物理缺氧模式;(2)构建共培养体系:共培养BV2细胞及视网膜脉络膜血管内皮细胞(RF/6A),或应用BV2细胞条件培养基;(3)Western blot检测:测定不同处理条件下,小胶质细胞HIF-1α、Basigin、IGF-1、AKT、P-AKT、ERK及P-ERK等蛋白的表达变化以及RF/6A细胞VEGF和VEGFR-2的表达变化;(4)实时定量-PCR(quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR):检测BV2细胞在不同处理条件下表达的Basigin-1和Basigin-2及IGF-1变化,以及RF/6A细胞VEGF和VEGFR-2的表达变化;(5)细胞迁移实验:利用transwell小室测定RF/6A的迁移能力;(6)管腔形成实验:Matrigel铺胶,Image Pro Plus软件测量管腔形成的长度。(7)si RNA转染:采用脂质体包裹si RNA沉默小胶质细胞Basigin-2的基因表达;(8)细胞因子测定:应用细胞因子芯片,筛选出小胶质细胞缺氧后上调,且在Basigin-2敲减后出现下调的促进血管生成的可溶性功能分子。(9)药物干预:分别应用AKT抑制剂(LY294002)及MEK抑制剂(PD98549)抑制AKT或ERK激活,分析其对IGF-1生成的作用;外源性给予IGF-1蛋白或IGF-1抗体及IGF受体拮抗剂,阻断或激活IGF-1信号,观察对RF/6A管腔形成的影响。(10)统计学分析:应用统计学软件SPSS 17.0版进行分析。多个样本组间均数的比较采用单因素方差分析,任意组间两两比较采用Student-Newmann-Keuls(SNK)检验,P0.05为差异有统计学意义。【研究结果】一、体内实验:Basigin在OIR模型视网膜新生血管簇周围聚集的小胶质细胞内高表达。与正常对照组相比,OIR模型视网膜冰冻切片及视网膜铺片从不同角度均显示,视网膜新生血管簇有明显的IBA-1阳性的小胶质细胞聚集,且小胶质细胞标志物IBA-1与Basigin在新生血管区域有显著的共表达。OIR组P17神经视网膜Basigin的蛋白水平组较正常对照组显著增加(P=0.0012)。二、体外实验:缺氧环境下,小胶质细胞增加Basigin-2表达,促进血管内皮细胞血管生成能力及其分子机制。1.缺氧增加小胶质细胞HIF-1α及Basigin-2的表达小胶质细胞表达的HIF-1α及Basigin蛋白随着物理缺氧时间的延长而增加。Basigin的蛋白表达在缺氧12h(P=0.0097)及24h组(P=0.0003)均较对照组显著增加。qRT-PCR检测发现,缺氧后的小胶质细胞仅表达Basigin-2,且随缺氧时间延长而增加。2.缺氧处理后的小胶质细胞促进血管内皮细胞的管腔形成缺氧处理后的小胶质细胞与血管内皮细胞共培养或其条件培养基,均能促进血管内皮细胞的管腔形成。接种后6h,共培养组管腔形成的长度均值比对照组增加60.80%(P=0.0001);条件培养基组均值比对照组增加52.40%(P=0.0003)。但共培养组与条件培养基组相比无明显差别(P=0.4008),提示对管腔形成的促进作用不依赖于两种细胞的直接接触。3.脂质体包裹si RNA成功沉默Basigin-2使用qRT-PCR及Western blot测定使用脂质体包裹的si RNA敲减Basigin后的干涉效果。si RNA Basigin 317和458两种序列都能明显下调Basigin的核酸及蛋白表达,但使用两种序列联合敲减较单独敲减组的效果更佳。4.阻断小胶质细胞Basigin-2表达抑制血管内皮细胞血管生成能力干涉小胶质细胞Basigin-2表达后,共培养条件下血管内皮细胞的迁移及管腔形成功能被抑制。敲减后迁移细胞数减少65.93%(P=0.0098);接种后6h,管腔形成长度减少68.27%(P=0.0001)。5.阻断小胶质细胞的Basigin-2表达抑制促血管生成因子的生成细胞因子芯片测定敲减小胶质细胞Basigin-2基因后血管生成因子的改变,筛选出IGFBP2,IGF-1,Pro-MMP9,VEGFR-1等4个因子在缺氧后上调;且在Basigin-2敲减后,出现下调。其中IGF-1表达改变最为显著,在缺氧后上调至基础值的3.11倍,敲减后下调为1.33倍。应用qRT-PCR及Western blot检测,BV2敲减Basigin-2后,IGF-1的转录水平下降(P=0.0001);蛋白表达下降(P=0.0082)。6.IGF-1促进内皮细胞的管腔形成培养基中分别加入IGF-1中和抗体及外源性IGF-1,结合对BV2的Basigin-2敲减,评价IGF-1对管腔形成的影响。接种后6h,模拟敲减联合IGF-1中和抗体组管腔形成减少28.83%(P=0.0098);Basigin-2敲减联合IGF-1可增加管腔形成60.32%(P=0.0002)。7.Basigin-2调控IGF-1表达的通路分析分别使用LY294002和PD98549阻断AKT或ERK通路,qRT-PCR检测BV2细胞不同处理组IGF-1的m RNA水平。Basigin-2敲减及AKT抑制剂能逆转缺氧后上调的IGF-1趋势。Western blot测定BV2细胞不同处理组HIF-1,Basigin,IGF-1,P-AKT,AKT,P-ERK及ERK水平。在蛋白水平,缺氧增加IGF-1表达,AKT抑制剂及Basigin-2敲减可以抑制IGF-1的产生,而ERK抑制剂不能抑制IGF-1的表达。8.IGF-1增强内皮细胞管腔形成能力的分子机制使用IGF-1受体中和抗体阻断内皮细胞的IGF-1信号,RF/6A的管腔形成长度减少101.33%(P=0.0001)。RF/6A表达的VEGF核酸和蛋白水平无明显改变;但VEGFR-2的转录下调(P=0.0091),蛋白表达减少(P=0.0006)。【结论】本研究首次报道了Basigin参与小胶质细胞对氧诱导的视网膜病变新生血管生成的调控作用,证实视网膜新生血管簇有明显的小胶质细胞聚集,且小胶质细胞Basigin表达水平显著增加。体外研究证实了缺氧后小胶质细胞表达Basigin-2对血管生成的正性调控作用,且该作用不依赖于细胞间的直接接触。继而以脂质体包裹si RNA为研究平台,重点观察沉默小胶质细胞Basigin-2表达后对于血管生成的影响,提出并初步揭示Basigin-2通过PI3K/AKT途径增加了促血管生成因子IGF-1的分泌,IGF-1上调内皮细胞VEGFR-2的生成,增强血管生成的内在分子机制。研究结果拓展了对小胶质细胞的认识,并且揭示了小胶质细胞表达Basigin-2作为递质,促进缺氧相关的视网膜新生血管生成的调控作用及机制,为拓展缺血缺氧性视网膜新生血管疾病的治疗提供了新的实验依据。
【学位授予单位】:第四军医大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R774.1

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